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  • 果胶在癌症治疗中的应用
  • 发布时间: 2019/5/15 点击次数:1191 
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      果胶在癌症治疗中的应用

          张文博”,张晗,徐萍2

          (I.新乡医学院生命科学技术学院,河南新乡453003;

          2.新乡医学院药学院,河南新乡453003)

          摘要:果胶是植物细胞壁中种以聚半乳糖醛酸为骨架、富含中性糖分枝结构的杂多糖。作为膳拿纤维的果胶能是常见的膳食纤维成分,能抑制结肠癌。果胶经改性可降解为低分子量、低酯化度、可生物利用的片段,重要的例子是改性柑橘果胶(MCP). MCP 可通过与半乳糖凝集素-3相互作用而抑制肿瘤生长、诱导细胞调亡、增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性、抑制肿瘤血管新生、抑制转移和增强机体免疫响应。果胶富有羧基、羟基等功能基团、易于修饰,是良好的抗肿瘤给药系统的材料。本文首先总结了果胶的结构特点,然后重点分析了可生物利用果胶片段的抗肿瘤机制、吸收机制和抗肿瘤构效关系等,最后展望了将果胶开发为功能食品或抗肿瘤药物存在的问题及前景。

          关键词:抗肿瘤,半乳糖凝集素-3,改性柑橘果胶,果胶,生物利用度

          引言

          果胶是一种从植物细胞壁获得的复杂多糖。商品化的果胶在食品和医药工业中可用作稳定剂、增稠剂、乳化剂和耐酸胶凝剂等,是种无毒无害的天然 食品添加剂和药物辅科(Wicker, 2014)。按照分子量或加工性质区分,果胶可以分为较高分子量的天然果胶和较低分子量的改性果胶。天然果胶常作为膳食纤维(dietary fiber, DF)存在于食物中。DF是一类不能在人胃肠道内消化、但能被大肠内微生物降解和利用的多糖或低聚糖,它们的分子量分布可在上万至上百万之间。膳食纤维果胶(下文简称DF-Pec对高血压、便秘等慢性病有定疗效,并具有降低血糖、血脂、减少胆固醇、解除铅中毒等作用(Zhang, 2006)。近年来,由于发现改性柑橘果胶(modified citrus pectin, MCP)具有抗肿瘤转移活性,其

    应用潜力引人注目(Leclere, Cutsem, & Michiels, 2013; Zhang, 2006)。

          全球每年约760万肿瘤死亡病例( World Health Organization, 2008)。尽管手术、化疗和放疗等传统手段以及免疫治疗、基因治疗、介入治疗等新手段不断改进,但是转移( metastasis )仍然是患者死亡的主因(Zhang, 2006; Zhang et al, 2013)。转移使手术治疗时间窗口丧失,而不得不采用放疗和化疗等对机体伤害大的方案。化疗药物采用细胞毒性(cytotoxicity) 模型筛选,治疗指数低、专一性差,而且肿瘤细胞耐药性往往导致化疗失败(Leclereetal,2013)。果胶在肿瘤治疗中的应用潜力,主要体现在以下几个方面: DF-Pec 对结肠癌的预防和治疗作用、改性果胶片段的抗肿瘤活性、果胶作为免疫增强剂、果胶作为药物载体。本综述重点对果胶在抗肿富治疗中的应用及作用机制进行总结。

    1.果胶结构

          果胶的结构-一般分 为三大类:同聚半乳糖醛酸(homogalaturonan, HG),鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I ( rhannogalacturonan-I, RG-I)和取代半乳糖醛酸聚糖( substituted galacturonans, GS ) (Caffall & Mohnen, 2009; Leclere et al, 2013;Zhang, 2006; Zhang. Liu, & Gao, 2010)。果胶结构随来源、加工工艺等因素变化较大,通常HG占约65%,RG-I 占20-35%,其它为GS,柑橘果胶(citrus pectin,CP)中的RG-I含量远高于RG-Il(Mohnen,2008)。HG是由D-半乳糖醛酸(D-galacturonic acid, GalpA)经a-1, 4糖苷键连接的直链分子。商业来源的CP其HG部分的长度大约为20 kD (Thibault et al,1993; Yapo, Lerouge, Thibault &Ralet, 2007)。按照GalpA的C-6位羧基甲酯化程度(degree of methylation, DM),果胶亦可分为高酯果胶和低酯果胶,它们在食品工业中的用途有很大差别。此外,GalpA其C-2或C-3位羟基可被乙酯化,并用DA来表示酯化程度( degree ofacetylation, DAc)。RG-I 含有由鼠李糖和半乳糖醛酸组成的核心重复片段:[(→4)-a-D-GalpA-(1→2)-a-L-Rhap-(1-)]n. RGI的GalpA-般不连接 其它支链。约20-80%鼠李糖的C4羟基连接有多种结构各异的支链,根据植物来源的差异主要存在三种类型的片段:由-(1,4)键连 接的寡聚半乳糖,I 型阿拉伯半乳聚糖(type I arabinogalactan, AG-I)和I1型阿拉伯半乳聚糖(type II arabinogalactan, AG-I)等三种类型.CP的RG-I主要由寡聚半乳糖AG-I组成, AG-I由B-(1,4)键和B-(1,3)键连接的两种类型的半乳寡聚唐组成。L阿拉伯糖常常以0(1,5)键连接到-(1,4)键组成的半乳寡聚糖的中间或末端(Gao et al, 2012b; Hinz et al, 2005)。RG-I1是主要的GS,但其结构特征与RG-I差异较大,其主链为HG结构,含有A和B两个侧链,每个侧链含有9个或10个糖残基通过至少22种糖苷键组成分支。高等植物果胶的另-种GS是木糖聚半乳糖醛酸(xylogalacturonan, XGA),它是在HG骨架上GalpA的O-3 通过B-糖苷键与木糖连接所形成的一种分支结构。

    2.膳食纤维果胶的抗肿瘤活性

          来源于相橘、苹果、马铃薯、甘薯等植物的膳食纤维果胶均具有抗肿瘤活性(Bergman, Djaletti, Salman & Bessler, 2010; Zhang, Mu, & Zhang, 2012)。DF-Pec的抗肿瘤作用机制可能与抑制肿瘤生长(Chengetal,2011)、抗突变保护作用(Hensel & Meier, 1999)、抑菌和免疫增强活性(Chen et al, 2006; Georgiev et al,2012)、调控转化相关microRNA和癌基因等有关。由于DF-Pec 基本上在肠道内起作用,因而,其抗肿瘤活性研究集中于结场癌(Cheng et al, 201 1; Schmidgall &Hensel, 2002)。

          果胶的抑癌作用直接或间接地与抑菌作用有关。寡果胶能够抑制肠道有害菌生长,而利于双歧杆菌(e.g. Bifidobacteria and Lactobacillus)等益生菌的生长,寡果胶作为益生元的效果优于果胶(Avivi-Green, Polak-Charcon, Madar &Schwartz, 2000a ; Olano-Marin, E., 2002)。果胶在结肠中发酵产生一一些短链脂肪酸(Short-chain ftty acids, SCFA),例如丁酸,能使肠道恢复正常菌群,并且通过促进结肠细胞调亡、加速隐窝细胞周转而抑制结肠癌(Avivi-Green,C,Polak-Charcon, S, Madar, Z. & Schwartz, 2000b; Rao, Chou, Simi, Ku, & Reddy,1998)。苹果果胶的抗癌作用机制包括降低粪便细菌中酶(β-葡萄糖醛酸苷酶、β葡萄糖苷酶和色氨酸酶)的水平(Ohkami et al, 1995)、 降低发癌剂氧化偶氮甲烷诱导结肠肿瘤的多发性(Ohnoetal,2000)、消除自由基(Urias-Oronaetal,2010)、减少DNA加合物水平(Zunft, Goldin-Lang, & Dongowski, 1997)等。偶氮甲烷( azoxymethane, AOM)能够诱发大鼠结肠癌,使得某些microRNA ( miR-16,miR-19b, miR-21, miR26b, miR27b, miR-93, and miR-203等)表达异常,富有多不饱和脂肪酸( n-3 polyunsaturated ftty acids (PUFAS))的鱼油能够抑制 microRNA介导的肿瘤转化。果胶能够增强鱼油的抑癌作用,在mRNA和蛋白质水平上抑制PTK2B,PDE4B,andTCF4等癌基因在癌症早期的作用(Shahetal,2011)。人参果胶PG-F2可抑制Helicobacter pylori对胃上皮细胞的黏附,可望预防胃癌的发生(Lee, et al, 2006)。

          此外,果胶的抗肿瘤活性或许通过增强免疫细胞活性而实现(Chengetal,2011; Jeonet al, 2011)。例如,高丽红参果胶(Korean Red Ginseng Pectin, KRG)KRG能增强NF-KB途径而活化巨噬细胞、抑制髓系抑制性细胞而增强T细胞活性(Choi et al, 2008; Jeon et al, 2011)。人参果胶GP能减弱L-929细胞的迁移能力(Fan et a.,2010),这或许能够降低肿瘤细胞的转移潜能。积雪草果胶具有刺激T细胞和B细胞增殖的免疫活性,这种活性的强弱受酯化度的影响(Wang, Dong,Zuo, & Fang, 2003)。

          3.可生物利用的改性果胶

          通过酸和碱(Glinsky & Raz, 2009; Platt & Raz, 1992)、加热(Cheng et al.2011;Jackson et al, 2007)、射线(Kang et al, 2006) 或酶处理(Olano-Martin, E.,. 2003;Zhang,Xu,Giao,Yan,&Yang,2013)等手段降低果胶分了量和酯化度而获得的改性果胶具有抗肿瘤活性。例如, pH改性柑橘果胶(pH-modified citrus pectin, MCP)在抑制肿瘤生长、抑制肿瘤血管新生、抗转移等方面均有活性,热处理果胶(heattreatedcitruspectin,HTCP)具有诱导前列腺癌细胞调亡的活性(Jacksonetal,2007),而热改性的人参果胶具有抑制结肠癌细胞HT-29的活性(Chengetal,2011)。通过20 kGy的y射线处理果胶,不仅不会产生细胞致突变效应,而且能够抑制HT-29等多种肿瘤细胞(Kang et al, 2006)。

          果胶能够在体内发挥抗肿瘤活性的前提是,需要有一-定的生物利用度,即能够进入血液循环,本文将这类改性果胶统称为可生物利用果胶片段( Bioavailablemodified pectin fragments, BMPFs). MCP是这类分子的主要代表,它是通过酸碱水解天然CP而获得的一种分子量更小、酯化度更低、分支结构更短的果胶衍生物(Nangia-Makker et al, 2002; Zhang, 2006)。为什么CP没有抑制肿瘤转移的活性,而MCP具有这一活性?首先,水解使果胶分子的物理性质发生变化,溶解度增加。碱使CP骨架HG通过B-消除作用而缩短,酯化度从大约80%降低至10%

    以下,果胶片段溶解度增加(Eliz, Hothkiss, Fishman, & Rode, 2006; Zhang et al,2010)。其次,分子的“药效基团”的含量与分布状态在水解过程中发生改变。由于呋喃糖形成的糖苷键比吡喃糖糖苷键对酸更敏感,因而果胶的RG-I的木寡聚糖、阿拉伯寡聚糖等片段的酸解速率大于半乳寡聚糖片段,酸使得果胶的骨架和毛发区链长缩短,部分阿拉伯半乳寡聚糖中的阿拉伯糖被水解,半乳寡聚糖被富集,从而增强了所谓“药效基团”--端β-半乳糖苷与其靶点半乳糖凝集素-3( galectin-3, Gal-3)的糖识别结构城(carbohydrate rcognition domain, CRD)间的作用(Krall & McFeeters, 998; Mrris, Gromer, Kirby, Bongaerts, & Gunning,2011)。高酯果胶在水中呈疏水团聚物或凝胶,而MCP分子是可溶的,其末端β-半乳糖残基易于“呈现"给靶分子Gal-3.另一个影响MCP药代动力学性质的参数是分子量。分子量可能会从吸收和消除两方面央定着血药浓度(Zhang,Gao,Shi,& Zhang, 2007)。 MCP 分子量在3 000-60 000范围(Gao et al, 2012b;Ramachandran et al, 201 1; Zhang et al, 2007;)。一种商业化的BMP5---GCS-100,其分子量大约为10 kDa。

          生物利用度的高低与药物的理化性质和吸收机制有关。BMPFs 的理化性质支持改性使其更容易被小肠微绒毛吸收、并直接进入血管进而在体内存留的假设。但是,尽管在对MCP用于重金属排毒和抑制肿瘤肺转移的研究中均表明低酯化度的果胶能鼓吸收(Eliaz, L, 2003; Pienta et al, 1995; Wai, AIKarkhi, & Easa,2010),然而缺乏足够的体内实验证据证明带有负电荷较多的分子可以被吸收。口服药物能否被吸收关键是能否被小肠上皮细胞吸收或者透过紧密连接(intracllular tight junction)。常采用Caco-2 双室模型研究药物吸收,用此模型对MCP的跨膜吸收进行的研究表明仅有果胶的中性寡糖片段穿越了膜,而富有半乳糖醛酸的果胶片段没有透过膜(Courts, 2013)。Maxwell等(Maxwell, Belshaw,Waldron, & Morris, 2012; Morris, Belshaw, Waldron, & Maxwell, 2013)比较了改性果胶与葡聚糖在理化和药代动力学性质方面的异同,认为果胶片段可通过被动吸收或细胞(例如,小肠上皮细胞、GALT、M细胞)主动捕获两种方式而修饰、转运和释放。有些生物大分子可以被受体识别而内吞,例如,B-葡聚糖能够被巨噬细胞的dectin-1 转运(Brown et al, 2002; Ozment, Goldman, Kalbfleisch, &Williams, 2012; Weigel, & Yik, 2002)。BMPFs 是否存在经由Gal-3结合被转运至

     细胞内的可能?上皮细胞细胞膜上某些糖蛋白可以被Gal-3识别并内吞(Gaoetal, 2012a)。因此,存在BMPFs被Gal-3结合而被细胞内吞的可能性。如果该假设成立,研究能够被Gal-3帮助而内吞配体的机制和配体的结构特点,对于提高配体的生物利用度和生物活性能够带来有益的结果。此外,在肝细胞表面有大量的C-型凝集素脱唾液酸糖蛋白( asialoglycoprotein rceptor, ASGP-R)能移转运一些带有半乳糖末端的糖蛋白进入肝细胞,考虑到BMPFs的确能够抑制肝癌(Liu et al, 2008; Straube et al, 2013; Zhang et al, 2010),因此,BMPFs在肝脏是否能够被ASGP-R转运值得进一一步探讨。

          BMPFs固然可以通过口服以外的途径给药( 例如注射),但是由于BMPFs亲水能力强,它透过膜系统的能力尚无法确认。Gal-3 能够在细胞膜表面、细胞质和细胞核中表达,也可以被释放到血液中而发挥作用。不同亚细胞位置的Gal-3具有不同的功能。Gal-3的抑制剂BMPFs能够在哪个亚细胞位置起作用,目前的研究尚不充分。

          4. BMPFs的抗肿瘤机制

          本文重点以MCP为例阐释BMPFs的抗肿瘤机制。MCP在抑制肿瘤生长.血管新生和转移等多个环节均能起作用,对前列腺癌的肺转移、黑色素瘤的肺转移、结肠癌的肝转移、乳腺癌、血管肉瘤的治疗等均有研究报道(Johnson et al,2007; Liu et al, 2008; Nangia-Makker et al, 2002; Platt et al, 1992; Pienta et al,1995),抗肿瘤机制涉及到对肿瘤大小的抑制、对化疗药物的增敏、对肿瘤转移过程的抑制和对免疫细胞的调控等几个方面。

          4.1改性果胶对肿瘤生长的抑制作用

          尽管部分报道显示,BMPFs 对肿瘤细胞既没有细胞毒性,也不能抑制其生长,但是,有些实验通过动物模型已经观察到MCP能抑制多种类型实体瘤大小的现象。能否产生抑制作用或许与肿瘤组织类型或BMPFs的器官分布或亚细胞分布有关Nangia-Makker et al, 2002; Platt et al, 1992; Zhang et al, 2010)。Raz 研究组(Nangia-Makker et al, 2002; Platt et al, 1992)人在应用结肠腺癌LSLiM6、乳

    腺癌MDA-MB-435等恶性高转移肿瘤细胞系研究MCP抗肿瘤转移的试验中观察到MCP有减慢肿瘤生长速度的作用。Hayashi等(Hayashi, Gillen, & Lott, 2000)研究了MCP对于移植了结场-25 (colon-25)肿瘤的balb-c小鼠肿瘤大小与重量的影响。触诊时触摸到肿瘤后第20天,低剂量组(0.8 g/L)和高剂量组(1.6 g/L)给药小鼠其肿瘤大小都显著地比对照组小。在低剂量MCP给药组,38%的小鼠肿瘤大小减小(p<0.02). 其中高剂量组更加明显( 70%的小鼠肿瘤减少,p<0.001)。对肿瘤的抑制可能涉及-一个或多个环节:例如,发癌过程(Liu et al,2010; Shah et al, 2011)、肿瘤细胞增生、凋亡途径等。

          前文已经论述了DF-pec对发癌过程的抑制作用。BMPFs 也能够抑制发癌过程。Mucin家族的蛋白是-种富含O-糖链的上皮细胞表达的糖蛋白,其表面的糖链是Gal-3的配体。Gal-3 能够在转录水平E通过激活AP-1 (a transcriptionfactor) 而上调MUC2(Song et al, 2005; Wong et al, 2011)。MUC2的异常表达与结肠癌的发生及转移相关。因而,BMPFs 有可能通过抑制Gal3而抑制MUC2相关的结肠癌的发生和转移。另外,结肠炎与结肠癌存在高度相关性,果胶能够通过抑制发炎而抑制发癌。NF-KB是使得LPS诱发结肠炎转化为结肠癌的-一个关键因素。来自于苹果果胶的半乳寡聚糖能通过作用于LPS/TLR4/NF-KB途径而抑制发癌(Liu et al, 2010)。

          MCP可能通过影响肿瘤细胞的细胞周期而抑制肿瘤细胞增殖。MCP使人前列腺癌细胞JCA-1生长减少、[H]嘧啶进入DNA的速率减弱、细胞周期素B、p34和cdc2基因的表达F调,其机制可能与细胞周期的早G2期有关(Hsich&Wu,1995)。MCP抑制肿瘤可能与Gal-3有关,而Gal-3能下调cyclin A和cyelin E的表达水平,但是对MCP对cyclin A和cyelin E的表达水平与Gal-3间关联的报道尚未见到。

          抑制肿瘤生存信号或者诱发其凋亡信号均能影响肿瘤生长。Gal-3 既与生存信号MAPK途径、Wnt途径有关(Lee, Lin, Chang. & Lo, 2013; Maxwell et al, 2012;Song et al, 2012),也与凋亡途径有关(Harazono, Nakaima, & Raz, 2013)。改性果胶PectaSol-C能够诱导LNCaP和PC3细胞的调亡(Yan, & Katz, 2010)。WB分析确认MCP能够抑制PC3和CASP11前列腺癌细胞MAPK途径的活化,并且增强下游促凋亡蛋白Bim的表达水平。因此,MCP对肿瘤的抑制可能既与肿瘤生

    存途径抑制有关,也与凋亡途径活化有关。改性果胶能否诱导凋亡,与其结构特征有关(Jacksonetal.2007)。因此,需要进:-步从构效关系的角度研究果胶与凋亡间的关联。

    4.2改性果胶对化疗药物的增敏作用

          某些肿瘤细胞能够抵抗化疗药物而不发生调亡,因此需要寻找化疗增敏剂来解决这一临床上的难题,而BMPFs是化疗增敏剂的重要候选分子。Gal-3 有利于维持肿瘤耐药性表型,因而针对Gal-3 的抑制剂能够逆转肿瘤耐药性(Fukumori,Kanayama, & Raz, 2007)。Chauhan等(Chauhan et al, 2005)采用商品来源的改性柑橘果胶GCS-100诱导对地塞米松、美法仑或阿霉素有抗性的人类多发性骨髓瘤细胞系的凋亡。不论是单独使用GCS-100,还是与地塞米松合用都能够抑制肿瘤生长、克服抗药性,并且提高病人恶性血癌的生存期。由于BMPFs能显著增强细胞对化疗药物的敏感性,这种组合给药方案有助于在临床上减少有毒的化疗药物剂量,延缓肿瘤耐药性的发生(Chauhan et al, 2005; Hossein, Keshavarz, Ahmadi,& Naderi, 2013; Jiang, Eliaz, & Sliva, 2013; Lu, Wang. & Liu, 2013; Wang, & Liu,2011)。GCS-100的这种化疗增敏作用可能与凋亡的外在途径和内在途径都相关(Chauhan et al, 2005)。

          化疗药物抵抗作用机制之一是由于Gal-3 干扰了TRAIL (Tumor necrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand) 与受体DR4和DRS间的相互作用,进而无法形成能够诱导调亡的复合物DISC (death-inducing signaling complex)而引起的(Mazurek et al, 2012)。BMPFs 或许能够在细胞外与Gal-3相结合,避免了Gal-3对TRAIL与DR4/DRS的干扰作用,从而使得肿瘤细胞对化疗药物由不敏感变为敏感。:

    4.3改性果胶对侵袭与转移的抑制

          侵袭与转移涉及肿瘤d管新生、失巢凋亡逃逸、血管内皮细胞黏附等的多环节,Gal-3 均参与这些环节。采用注射的方法(Platt et al, 1992)、 口服MCP的方法(Pienta et al, 1995)以及临床实验(Guess et al, 2003),都证明MCP在体内具有

      抑制肿瘤转移的活性。Platt 等(Platt et al, 1992)最早报道,注射MCP可明显减少小鼠植入B16-F1黑色素瘤细胞后的肺部集落,而CP则增加其肺部集落。MCP可抑制B16-F1黑色素瘤细胞黏附到层黏连蛋白和脱唾液酸胎球蛋白诱导的同型聚集,但CP不具有这种抑制作用。两种糖都能抑制B16-F1黑色素瘤细胞在半固体培养基,如琼脂糖中的非锚地依赖性生长(Nangia-Makkeret al, 2002)。这一结果表明,由细胞表面的Gal-3介导的糖识别可能参与细胞-ECM相互作用,并在体内肿瘤细胞栓塞和细胞锚地依赖性生长中起重要作用。

          在转移过程中发生失巢调亡逃逸,对于转移成功特别关键。Gal-3 是一-种抗调亡蛋白,通过过表达,它能够使细胞周期在Gi期发生阻滞,下调Gi-S期细胞周期素水平(cyclin E和cyclin A),上调相关抑制蛋白(p21WAFI和p27KIP1)水平,使线粒体自稳(Kim, Lin, Biliran, & Raz,, 999 Matrrese et al, 2000。因而,抑制Gal-3有可能诱发失巢调亡。Vayssade 等(Vayssade et al, 2010)采用黄秋葵果胶RG-I使采用polyHEMA悬浮培养的具有高度转移潜力的BI6F10细胞停留在G2/M期,表明RG-I有可能诱导肿瘤细胞发生失巢调亡。黄秋葵RG-I使肿瘤细胞表面的N钙黏素以及o5整合素的表达F调。由于黄秋葵果胶含有几乎纯的寡聚半乳糖,因而这种失巢调亡作用可能是经由Gal-3介导的。不过,对于Gal-3介导抗失巢凋亡逃逸过程,是否需要Gal-3I进入胞内,大分子的改性果胶能否进入细胞内,如何进入细胞内,参与调亡内在途径还是外在途径,BMPFs 是由于抑制肿瘤细胞的同型聚集还是异型聚集而产生抗失巢调亡逃逸等细节问题,需要更多的实验来回答。

          肿瘤fm管新生是肿瘤转移成功的另--关键环节.通过对人脐带静脉内皮细胞(HUVECs)在Matrigel上毛细管形成现象的评价来研究在体外肿留血管生成中MCP对Gal-3介导功能的影响。通过使用Boyden小室法和标记测定法分别研究MCP对于Gal-3诱导的HUVEC的趋化作用和HUVEC对MDA-MB-435细胞的体外结合作用。饲喂MCP的小鼠其体内肿瘤生长、血管生成及自发肿瘤转移都显著地减少。在体外,MCP以剂量依赖方式抑制HUVEC的形态发生(毛细血管形成).MCP也以剂量依赖的方式抑制表达Gal-3的MDA-MB-435对HUVECs的黏附(Nangia-Makker et al, 2002)。由于肿瘤细胞栓塞并不足使毛细血管对其造成截流,转移的肿瘤在靶器官的阻滞,需要肿瘤栓塞表达的Gal-3与血管腔TF

      抗原( Thomsen-Friedenreich glycoantigen )间的黏附作用来辅助完成(Glinskii et al,2005),因此,BMPFs或许可以抑制肿瘤细胞栓塞过程。栓塞不能形成有可能进一步导致肿瘤细胞发生失巢调亡。

          4.4改性果胶对免疫细胞的作用

          改性果胶对免疫细胞的作用机制有两种:第一、 作为免疫调节剂(biologicalresponse modifers, BRMs) (Radosavjevic et al, 2012);第二,抑制免疫监视。作为BRMs,MCP活化多种类型的免疫细胞。例如,MCP以剂量依赖方式活化Tc细胞和B细胞。MCP激活的NK细胞使癌细胞K562发生凋亡(Ramachandran et al,2011)。Gal-3 有可能使得T细胞释放INF-y的能力受损,而Gial-3的配体能够修复这种受损。GCS-100能够强化CTL的细胞毒效应,使其释放更多的INF-y(Demotte et al, 2010)。

          许多类型的肿瘤与Gal-3的表达成正相关。肿瘤患者血液中游离Gal-3的浓度高于正常值(lurisci et al, 2000)。游离Gal-3能抑制T细胞的生长,导致其发生凋亡,造成肿瘤的免疫耐受(Peng, Wang, Miyahara, Peng, & Wang, 2008)。BMPFs或许能够抑制游离al-3对T细胞的调亡调控作用,但需要进一步的实验证据来验证。

          4.4临床研究

          MCP已进行II期临床预试验(Guess et al, 2003),目前有公司正在对改性果胶PectaSolC招募I1期临床实验受试者(t:/:/www linicaltialgoy/, NCTID=NCT01681823, f.)。笔者未在互联网上检索到MCP的IND申请信息。Guess等(Guess et al, 2003)研究了13名患者对MCP (Pecta-Sol*)的耐受性,并对其中10名受试者研究了MCP的疗效,以前列腺特异抗原倍增时间PSADT的变化作为主要研究终点(primaryendpoint)。服用MCP12个月后,与未服用前比10名患者中的7名其PSADT延长(p<0.05).该项研究结果暗示,MCP有可能使前列腺癌患者的肿瘤生长速率变慢。但是该项研究选择的受试者数目比-般的I期临床注册所要求的数目少,因而需要谨慎解释该项研究的结果。该报告中未披露

      MCP的批号,未设计安慰剂对照组,未提供肿瘤变化的直接信息,因而无法建立肿瘤改善与服用MCP之间的因果关联。Azemar 等(Azemar, Hildenbrand,Haering, Heim, & Unger, 2007)对49名晚期实体瘤的患者进行了一次临床预实验,目的是评估病人对MCP的耐受情况、临床和抗肿瘤效果。经过两轮治疗,11/49(22.5%)的病人病情稳定,6/49 (12.3%)的病人病情稳定超过24周,1 个罹患前列腺癌的病人在治疗16周后其血清PSA水平降低了一半。总体而言,经MCP治疗的病人具有临床上的受益,提高了生活质量、减缓了疼痛,因而,MCP .有继续进行临床研究的价值。该报告采用的MCP与Guess等研究的样品不同,其酯化度低于20%、采用加热处理过,但是未提及加热过程是否与HTCP的制备相同。

          此外,果胶给药系统也在进行着临床研究(NCT01681823)。MCP的临床研究不限于肿瘤(NCT01960946 & NCT01717248),不过这些研究对于理解MCP的毒理学、药代学等性质有帮助。

          5.构效关系研究

          果胶结构非常复杂,以其为原料制得的改性果胶,尽管经过了初步纯化和分组,但在微观上是不均-的。张文博(Zhang, 2006)按照文献方法(Platt et al, 1992)以中国产商业果胶为原料获得的MCP通过HPSEC或电泳等方法证明其是单分布,而采用十六烷基三甲基溴化铵在MCP中能沉淀出大约1%的中性多糖片段。Gao(Gao et al, 2012b)采用DEAE纤维素层析柱将MCP的中性多糖片段(MCP-N)纯化出来。由于酸性片段和中性片段具有不同的性质,因而,阐明BMPFs构效关系需要制备出结构更加均一和- -致的果胶片段,而反过来, BMPFs构效关系的研究能指导BMPFs改性方法的优化。

          BMPFs的半乳糖末端含量及以及其分支处的结构是BMPFs存在抗肿瘤活性的关键因素。越来越多的研究者关注果胶RG-I片段的活性(Gao et al, 2012b;Gunning, Bongaerts, & Morris, 2009),来自果胶RG-I的片段能够与Gal-3发生直接的相互作用。荧光显微镜、流式细胞仪和原子力电镜技术均证实,果胶的半乳寡聚糖部分能够与人类重组的Gal-3相结合(Gunning et al, 2009)。B-D-聚半乳糖与Gal-3间的解离常数为0.33 s(Gunning, Pin, & Morris, 2013)。黄秋葵果胶和

    马铃薯果胶含有较高比例的RG-I片段(Cheng et al, 2013; Vayssade et al., 2010),它们均具有抗肿瘤活性.Gao等(Gaoetal,2012b)制备的MCP-N属于果胶的AG-I型片段。他们将MCP-N用a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶处理,得到中性果胶片段M-MCP. M-MCP是一种分 子量约为18 kDa的含有B-1,4糖苷键的半乳寡聚糖片段。用酸降解M-MCP得到的半乳寡聚糖比AG-I类型的果胶片段具有更强的Gal-3抑制活性。

          BMPFs可使肿瘤细胞产生失巢调亡(Glinskyetal,2009;Newlaczyl&Yu,2011)。凋亡活性与果胶的哪类结构相关?HG片段单独能否诱导肿瘤细胞凋亡?单单RG-1片段能否诱发失巢凋亡?需要更多的实验性研究来回答这些问题。HG可否诱导调亡存在不-致的报道Attari, Sepehri, Delphi, & Goliaei, 2009; Cheng etal, 2011; Jackson et al, 2007; Yan et al, 2010)。Jackson 报道(Uackson et al, 2007)通过对CP热处理获得HTCP,使HG产生- -些具有诱导调亡的活性、而天然果胶不具有的结构,但是该结构尚未得到分离。经酸碱改性的果胶不具备诱导调亡的活性。HG经过B-消除改性会产生不饱和糖残基,这种糖残基或许与MCP的诱导NK细胞的活性有关(Ramachandran et al, 2011)。经过热处理,果胶会经B-消除产生带有还原性的不饱和糖残基的、或者发生重排的或带有糖酸类结构特征的片段,到底哪-类结构特征诱导肿瘤细胞凋亡活性,尚无进一步的报道。

          现有文献尚不足以支持仅仅RG-I部分起到抑制肿瘤的作用(Bergman et al,2010; Cheng et al, 2013; Kang et al, 2006)。尽管Gal-3通过CRD主要与BMPFs的半乳寡聚糖发生专- -的相互作用,但是,HG骨架并非对BMPFs的抑制Gal-3的活性毫无贡献(Gao, X.,et al, 2013)。首先,Gao (Gao, et al, 2012b)按照是否含有GalpA用色谱方法将MCP分离为两组---含有GalpA的组称为MCP-A,不含GalpA的组称为MCP-N,前者对Gal-3的亲和力远远高于后者。其次,果胶片段含有GalpA的骨架对于维持半乳寡聚糖末端片段的构象有贡献。分布于HG骨架上的多个半乳寡聚糖能够与Gal-3发生协同相互作用(Gao,et al, 2013)。糖配体与凝集素间如果发生多价效应,则其相互作用强度将增加(Witmann,V.&Pieters, RJ.. 2013)。BMPFs. 上HG骨架,对于这些半乳寡聚糖配基而言,起到“桥”的作用。再次,在生理pH下不能排除HG骨架与Gal-3的CRD之间发生电荷相互作用的可能性。Gal-3 (uniprot/P17931) 的CRD含有大约135aa,位

      Gal-3的C端( Seetharaman, J, 1998)。采用Expasy 数据库的pI预测工具tp:/:/web.expasy. org/compute pil)分析,表明CRD部分(pI=9.41) 在生理pH下呈正电荷,而HG骨架因富含羧基而呈负电荷。Gao(Gao,et al, 2013)观察到了几乎不含半乳糖的果胶骨架与Gal-3间的相互作用,而这种相互作用不受乳糖的抑制。因此,BMPFs 的骨架有可能与CRD之间发生非专- -的相互作用。CRD存在与Type-C自聚集有关的位点(Lepur, Salomonsson, Nisson, & Lefler, 2012)。BMPFs的骨架或许可以通过调节Type-C自聚集而影响CRD的作用。

          Gal-3作为肿瘤靶点越来越引人关注,目前已经开发了许多半乳糖凝集素凝集素抑制剂( galectin-3 inhibitor, Gal3I ) (Klyosov, 2012; Pieters, 2006; Zhang,2009), Gal3I 在肿瘤检测和治疗方面有着巨大应用潜力。对于靶蛋白Gal3而言,开发其抑制剂,并非只有以BMPFs为先导分子这一条路径,它受到其它方面的挑战。首先,类药性Druglikeness及成药性drugability是评价先导分子能否继续开发成为药物候选物的重要标准。合成的Gal3I具有分子结构确定的优势,其类药性和成药性比BMPFs更好。在研究化学合成的Gal3I过程中,获得了许多Gal-3的CRD与配体间相互作用的规律。这些规律对于进一步优化基于BMPFs的结构有所帮助。化学合成的Gal-3I尚无毒理学研究,因而,从其它植物、尤其是食物资源中筛选出Gal-3I的研究已经广泛开展(Mossine, V, 2008; Sathisha, Jayaram,Nayaka & Dharmesh, 2007)。目前,尚缺乏一套广 泛认可的、高通量的Gal-3I筛选方法,能在BMPFs中及其它类型Gal-3I文库中筛选出活性更高、毒性更小的片段。研究BMPFs的抗肿瘤构效关系、代谢动力学等有助于推动筛选方案的建立,有利于获得性能更优越的先导分子。,

          BMPFs.上的其它糖残基,例如阿拉伯糖会对其活性产生影响。Gao(Gao,et al,2013)观察到阿拉伯糖既可以增加、也可以减少半乳寡聚糖片段与Gal3间的相互作用。有的凝集素其配基的倒数第二个糖残基会影响其识别专-性(Nakahara,&Raz,A.2008).。目前尚未有研究BMPFs其他末端糖残基对其专-性影响的报道。由于体内有十几种半乳糖凝集素,因而,对配体末端赔残基的结构研究是必要的。

          Gal-3与多种疾病有关,BMPFs如何影响Gal-3相关的疾病,研究例子不多。一个有关的例子是,MCP对小鼠实验性肾损伤有保护作用,这可能与MCP调低

      Gal-3的表达水平有关,同时MCP不影响Gal-1 和Gal-9的表达水平(Kolatsi-Joannou, Price, Winyard, & Long, 2011)。体内存在其它活性各异的半乳糖凝集素(至少有十五种),它们均识别具有半乳糖未端的分子,因而不能排除BMPFs与Gal-3 之外的半乳糖凝集素发生相互作用的可能性(Heusschen,Grifioen, & Thissen, 2013)。BMPFs 其体内的靶点除Gal-3外,是否还能够与其他家族的半乳糖凝集素(例如ASGP-R)、细胞因子(Liu et al, 2001; Salman,Bergman, Djaleti, Orlin, & Bessler, 2008)、死亡受体(Chauhan et al, 2005)相互作用,有待进一步研究。

          6.果胶在抗癌给药系统中的应用

          果胶是一种许多国家批准使用的药物辅料。由于它具有羟基、羧基等功能基团,易于修饰,无毒性,因而在给药系统中应用广泛。按照给药途径,果胶给药系统分为胃肠道(经口服)给药和非胃肠道给药。胃肠道给药的重要方式是结肠给药系统(colon-specific drug delivery system, CSDDS),采用口服给药,能增加病人接受治疗的顺应性(Dev, Bali, & Pathak, 2011; Wong, Colombo, & Sonvico,2011)。利用结肠内细菌释放的酶可以降解果胶导致释药的原理以及对果胶进行凝胶化、钙化、聚合成新共聚物的方法可以制备CSDDS, CSDDS能增强某些药物的生物利用度。药代动力学实验证明,基于果胶的CSDDS具有良好的局部释药能力,有利于治疗结肠癌(He, Du, Cao, Xiang, & Fan, 2008)。非胃肠道给药需要使用改性的果胶。例如,- -种以酰胺化果胶为载体的DNA载运系统,使用了带有正点电荷的果胶改性分子,能够使外源基因转化进入HEK293细胞内(Katavet al.2008)。低酯果胶(分子量< 50 00Da)与阿霉素轭合的给药系统,经鼠模型体内实验证明,能抑制黑色素瘤转移(Tang et al, 2010)。果胶的RG-I片段富含末端半乳糖,而肝脏表面的一种半乳糖凝集素- -ASGP-R 或许能够识别这类糖残基。因而,利用果胶或者MCP能开发针对肝癌的器官靶向给药系统(Yuetal,2014)。

          此外,果胶可以直接经修饰与抗肿瘤药物进行化学交联设计前药系统,或制备成水凝胶、微球等各种形式的抗癌药物缓释系统(Puga, Lima, Mano, Concheiro,& Alvarez-Lorenzo, 2013; Takei, Sato, ljima, & Kawakami, 2010),这些给药系统有

    利于减轻化疗药物的毒性或改善其生物利用度.治疗癌痛的果胶轭合酚酞尼给药系统已经进入临床研究(NCT02050503)。

    7.结语

          本文对DF-Pec、BMPFs及果胶给药系统在抗肿瘤治疗方面的应用进行了总结,并重点对BMPFs的抗肿瘤机制和构效关系进行了详细分析。天然果胶结构复杂、抗肿瘤果胶功能食品规格不一,不过大部分报告支持DF-Pec能防治结肠癌,其机制涉及抑制发癌和免疫调节。细致理解DF-Pec 的抗肿瘤构效关系有助于改进产品功效,以获得结构和工艺更- -致、可控的产品,有助于获得效果更佳的基于果胶的保健品(nutraceutical)(McCarty & Block, 2006)。总体而言,将果胶及其改性物开发为抗癌药物的载药材料所面临的挑战少于将BMPFs开发成为抗肿瘤药物的过程。

          一些机构开始着手将BMPFs开发成药物,但还存在很多问题有待解决。例如,果胶结构如何受加工过程和肠道菌群的影响;剂型和果胶的凝胶化如何影响其生物利用度;采用怎样的标准优化改性过程;如何控制其分子量分布( Zhang, etal, 2010);如何完善质量控制方案;在体内还有哪些因素影响BMPFs与靶点间的相互作用;BMPFs在抗肿瘤失巢凋亡方面在胞内起作用还是在胞外起作用;BMPFs在体内是否会整合铂类药物?人体能够产生一种针对鼠李糖的抗体(Pazur, Erikson, Tay, & Alen, 1983)。如果BMPFs存在少量末端鼠李糖糖苷,长期反复使用BMPFs是否会诱导体内产生清除它们的抗体?BMPFs可以治疗Gal-3相关的其他疾病(KolatsiJoannou, 2011),对这些疾病的治疗会对肿瘤治疗产生什么影响?进一一步的工作能够改善BMPFs的活性或者扩展其应用领域。例如,是否可以通过将BMPFs进一步修饰获得生物利用度或亲和力更好的片段?与吸收促进剂配合可否增加其生物利用度?能否将BMPFs轭合荧光分子标记或者量子点,成为Gal-3、循环肿瘤细胞或者微转移的检测试剂、示踪剂? BMPFs直接还是间接影响细胞因子的功能(Dennis, Lau, Demetriou, & Nabi, 2009) ?针对如此之多的问题,作者的建议是应重点深入研究Gal-3的功能与表达情况、器官分布、BMPFs 的构效关系,获得更多的药效学、药代学以及临床研究数据。

    Acknowledgement

          This work was supported by the Guide Project of Science and TechnologyResearch of Henan Education Department (12B350006). Authors would like todeclare no conflicts of interest.

    Abbreviations

    AG-I, type I arabinogalactan; AG-II, type I arabinogalactan; ASGP-R,asialoglycoprotein receptor; BMPF, Bioavailable modified pectin fragment; CP, citruspectin; CRD, carbohydrate recognition domain; CSDDS, colon- specific drug deliverysystem; DF, dietary fiber; DF-Pec, dietary fiber pectin; DM, degree of methylation;ECM, extracellular matrix; Gal-3, galectin-3; Gal-3l, galectin-3 inhibitor; GALT,gut-associated lymphoid  tissue;  GS, substituted  galacturonans;  HG,homogalacturonan; HTCP, heat-treated citrus pectin; MCP, modified citrus pectin;PUFA, polyunsaturated fatty  acids; RG-I, rhamnogalacturonan-I; RG-II,rhamnogalacturonan-I; SCFA, short-chain fatty acids; XGA, xylogalacturonan.

    References.

          Attari, F., Sepehri, H., Delphi, L., & Goliaei, B. (2009). Apoptotic and necroticeffects of pectic acid on rat pituitary GH3/B6 tumor cells. Iranian Biomedical Journal,13(4):229-36.

          Azémar, M., Hildenbrand, B., Haering, B., Heim M.E. & Unger, c. (2007).Clinical benefit in patients with advanced solid tumors treated with Modified CitrusPectin: a prospective pilot study. Clinical Medicine: Oncology, 1:73. -80.

          Avivi-Green, c., Polak-Charcon, s.. Madar, Z., & Schwartz, B. (2000a).Apoptosis cascade proteins are regulated in vivo by high intracolonicbutyrate concentration: correlation with colon cancer  inhibition. OncologyResearch, 12(2): 83-95.

          Avivi-Green, c.. Polak-Charcon, S., Madar, Z, & Schwartz, B. (2000b). Dietary

     Application of Pectin in Cancer Therapy: a Review

          Wenbo Zhang". Han Zhang", Ping Xu*

          (a. School of Life Science and Technology, Xinxiang Medical University, XinxiangHenan 453003, PR China; b. School of Pharmacy, Xinxiang Medical University,

          Xinxiang Henan 453003, PR China)

          Key words: cancer therapy, galectin-3, modified citrus pectin, pectin



     



     



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