低分子柑橘果胶对结肠癌细胞奥沙利铂敏感性的影响

汪峰  刘海鹰

 实用医学杂志2011年第27卷第21 期

摘要  目的：比较奥沙利铂单药及联合低分子柑橘果胶（LCP）体外抑制结肠癌细胞的增殖效应，探讨LCP是否影响人结肠癌细胞对化疗药物奥沙利铂的敏感性。方法：不同浓度的奥沙利铂单药及联合LCP作用于对数生长期的人结肠癌细胞HT29、HCT116、SW116、SW480，通过形态学观察、四甲基偶氮唑盐法（MTT）细胞活力测定等检测对人结肠癌细胞敏感性的影响。结果：不同浓度的奥沙利铂对结肠癌细胞的生长均有抑制作用，而不同浓度的LCP抑制作用不明显，LCP与奥沙利铂联合作用于人结肠癌细胞可增强奥沙利铂对人结肠癌细胞的抑制效果。结论：LCP能增加奥沙利铂对人结肠癌细胞的敏感性，为将LCP推向结直肠癌治疗的临床试验和提高结直肠癌疗效提供理论依据。

关键词   结肠肿瘤；奥沙利铂；低分子柑橘果胶； 化疗增敏

结肠癌是一种常见的恶性肿瘤，在我国，近几年结肠癌成为发病率上升最快的癌症之一。除手 术治疗外，内科治疗在结肠癌治疗中起重要作用。但以目前临床治疗效果来看，大剂量应用化疗对机体的不良反应明显增加，同时极易产生化疗药 物的敏感性下降和耐药。因此，寻找可增强化疗药 物敏感性的药物极为重要。半乳凝集素－3（Gal-3）蛋白是一种重要的肿瘤相关蛋白，它能通过一系列信号转导稳定线粒体膜电位，抑制细胞凋亡，降 低铂类药物化疗敏感性。本课题旨在探讨Gal-3配体的竞争性抑制剂——低分子柑橘果胶（LCP）是否具有奥沙利铂的增敏作用，以期为结肠癌的临床治疗提供指导。

材料与方法

1.1一般资料 人结肠癌细胞HT29、HCT116、SW116、SW480获赠于广东省人民医院医学研究中心。RPMI-1640培养液、新生小牛血清、0．25％胰蛋 白酶（美国Gibco）；四甲基偶氮唑盐（MTT上海华 舜）；二甲基亚砜（DMSO美国Sigma）；Gal-3兔多克隆抗体（B2C10美国SANTACRUZ）；抗兔二抗（美国CST）。奥沙利铂（乐沙定）；LCP（美国圣特 莱）；SynergyTMMx多功能酶标仪（美国BioTek）；二氧化碳培养箱（英国Thermo）。

1.2方法

1.2.1 细胞培养 4种人结肠癌细胞均为贴壁细胞，将细胞置于10％新生小牛血清和青链双抗的RPMI-1640培养液中，37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养，细胞单层贴壁生长，待长至80％～90％细胞发生融合时，用含0．25％的胰酶和0．02％EDTA消化细胞传代培养，收集对数生长期细胞用于实验。1.2.2 Westernblot分析Gal-3蛋白的表达取对数生长期的上述4种细胞，消化成5×103／mL的单细胞悬液，提取细胞总蛋白，用预冷的PBS洗涤细胞3次，加入裂解液，冰上作用20min，4℃、12000r／min离心10min。上清液保存于－20℃。采 用Bradford法测定蛋白浓度。电泳、转膜。37℃封闭 90min，加一抗4℃孵育过夜，TBST漂洗后加入二抗，37℃摇床混合1h，洗膜后加入增强化学发光 底物，检测杂交信号。

1.2.3 MTT实验检测细胞增殖收集对数生长期的细胞，制备成5×103／mL的细胞悬液，每孔100μL 接种于96孔板，边缘孔用无菌PBS填充。37℃、5％CO2培养24h，实验分组，加入不同浓度的药物 100μL，每孔终体积为200μL。各组药物浓度：（1）奥沙利铂组：256、128、64、32、16、8μmol／L；（2）LCP组：0．25、0．5、1、2、4、8mg／mL；（3）联合组：单药组奥沙利铂＋5mg／mLLCP（预实验LCP对细胞增殖抑制呈剂量依赖性，常温下LCP完全溶解时浓度为5mg／mL）；（4）空白对照组：加入 100μL培养基。各药物浓度设6个复孔。72h后各孔加入5mg／mL的MTT试剂20μL，继续孵育4h，弃上清，加入DMSO150μL，室温下震荡溶解 10min，待紫色结晶完全溶解，酶标仪测定570nm 波长吸光度值。重复3次。细胞抑制率（％）＝（1－实验组平均OD值／对照组平均OD值）×100％  1.2.4 绘制生长曲线 细胞培养过程同上，实验分组。各组药物浓度为：（1）单药组：IC50浓度奥沙利铂；（2）联合组：IC50浓度奥沙利铂＋5mg／mL LCP；（3）空白对照组：100μL培养基。每孔200μL，每组各设6个平行孔，于37℃、5％CO2培养0～5d，每天取1块96孔板酶标仪上测定570 nm波长光密度值。使用GraphPadPrism5软件绘制生长曲线。

1.3 统计学分析 应用SPSS13．0统计软件处理数据。实验结果用x±s表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1Westernblot分析Gal-3蛋白的表达 Gal-3是半乳凝素家族的一员，广泛分布于各种正常细胞及肿瘤细胞。W-B分析表明，4种人结肠癌细胞均表达该蛋白（图1）。

2.2 MTT法检测LCP对人结肠癌细胞增殖抑制效应 LCP在体外对4种人结肠癌细胞均有增殖抑制作用，该抑制效应呈剂量依赖性。因高浓度的LCP无法溶解，无法求出IC25及IC50值。本实验 联合组均给予常温下LCP最高溶解浓度5mg／mL （表1）。

2.3MTT法检测奥沙利铂单药及联合LCP对人结肠癌细胞增殖抑制效应奥沙利铂对4种人结肠癌细胞的IC50值分别为：HCT11634．00μmol／L、HT29 14．73μmol／L、SW11627．68mol／L、SW48022．26 mol／L。联合LCP后，各浓度组奥沙利铂对人结肠癌 细胞的抑制作用更加明显，两组间各浓度细胞增殖抑制率具有统计学差异（P＜0．05）。见表2。

2.4绘制生长曲线观察奥沙利铂单药及联合用药作用后细胞增殖情况根据连续0～5d的MTT  测试结果，绘制生长曲线（图2）。与空白对照组相比，用药组具有显著的细胞抑制作用。联合用药组较单药组细胞增殖能力降低更加明显，具有统计 学意义（P＜0．05），两用药组间差异随时间增加。

2.5倒置显微镜下观察细胞形态变化正常生长的结肠癌细胞均于2h开始贴壁，24h处于对数 生长期。细胞贴壁牢固，折光性好，胞质透亮，细胞较清晰。镜下观察IC50浓度奥沙利铂单药作用后72h的细胞形态，各细胞系均出现细胞贴壁减少，细胞圆缩，胞质内可见较多颗粒，折光性差。联 合组该现象更加明显，并出现细胞间隙增宽，悬浮 细胞比例增加且碎片多见。

3.讨论

奥沙利铂是结肠癌化疗的主要药物之一，在其治疗结肠癌的过程中，肿瘤细胞能够通过一系列机制降低化疗敏感性，致使耐药产生。研究发现，Gal-3是一种重要的肿瘤相关蛋白，它是铂类药物化疗敏感性降低及耐药形成的主要机制之 一。Hsu等［1］证实铂类药物能诱导细胞核内的Gal-3 磷酸化并转运至胞浆内，后者抑制Bad蛋白的表 达和功能并诱导其112位上的丝氨酸磷酸化，稳 定线粒体膜电位，抑制细胞色素C释放和caspase-3活化，从而起到抗凋亡和增加耐药性作用。Oishi［2］、Wongkham等［3］分别在高表达Gal-3的卵 巢透明细胞癌与胆管癌研究中证实，应用小分子 干扰RNA转染敲除Gal-3，可明显增加上述细胞对铂类药物的敏感性和凋亡比例。

LCP是一种从柑橘类水果的果皮及果浆中提取出的水溶性多糖类化合物，经过高pH及高温处理后具有抗黏附和促凋亡的作用。其抑制肿瘤细胞黏附与转移的作用已明确［4］。本课题组既往研究亦证实，该药物能有效抑制小鼠结肠癌肝转移［5］。其他研究中，Chauhan等［6］研究显示通过抑制Gal-3的功能，LCP能逆转多发性骨髓瘤细胞对硼替佐米的耐药性，并增强其对地塞米松诱导凋亡的反应性；Johnson等［7］亦证明LCP能显著增加血管肉瘤细胞对多柔比星所诱导凋亡的敏感性。作为Gal-3配体的竞争性抑制剂，LCP具有通过封闭Gal-3的结合位点阻断其生物学功能，增加细胞毒性药物所诱导的凋亡，明显提高常规化疗效率的潜力。目前国内外尚未有LCP与奥沙利铂联合应用于结直肠癌的文献报道，故本实验首次联合二者对结肠癌细胞进行增殖抑制实验，探讨LCP 是否影响人结肠癌细胞对化疗药物奥沙利铂的敏感性。

 本研究发现，奥沙利铂在体外对4种人结肠癌细胞均有明显的增殖抑制作用，其抑制效应具有剂量依赖性。LCP与奥沙利铂联合应用具有协同效 应，能够使奥沙利铂对人结肠癌细胞的抑制作用显著增加。我们推测，该增敏作用可能与LCP抑制细胞Gal-3蛋白对铂类药物的拮抗作用有关。

综上所述，LCP能够增加奥沙利铂的抑制细胞增殖能力。其低毒与无明显副反应的特性，能降 低大剂量化疗药物的使用，减轻机体的损害，可作为铂类药物的增敏剂应用于临床，为手术治疗效 果较差的晚期结肠癌化疗提供选择。

Effect soflow-molecular-weight citrus pectin on the sensitivity of colon cancer cell lines to oxaliplatin WANGFeng，LIUHai-ying．Department of Gastrointestinal Surgery，the Affiliated Tumor Hospital of Guangzhou Medical College，Guangzhou510095，China

【Abstract】 Objective To compare the effect of oxaliplatin solo and the combination of oxaliplatin and lowmolecular-weight citrus pectin （LCP） on the proliferation of colon carcinoma cell lines in vitro， and investigate whether LCP would influence the sensitivity of these cells to oxaliplatin． Methods Human colon carcinoma cell lines HT29， HCT116， SW116， SW480 were subjected to oxaliplatin or oxaliplatin plus LCP in various

concentrations for 72 h， and the sensitivity of these cells to oxaliplatin was tested by cell morphology observation and activity testing by MTT． Results There was suppressing effects of different concentrations of oxaliplatin on human colon carcinoma cell lines HT29， HCT116， SW116， SW480． LCP could strengthen the inhibiting effect of oxaliplatin on human colon carcinoma cell lines． Conclusion LCP could increase the sensitivity of human colon carcinoma cell lines to oxaliplatin.

4.参考文献

1.HsuDK，YangRY，LiuFT．Galectins in apoptosis ［J］．Methods Enzymol，2006，417：256－273．

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3.WongkhamS，JunkingM，WongkhamCH，etal．Suppression of galectin-3 expression enhances apoptosis and chemosensitivity in liver fluke-associated cholangiocarcinoma［J］．CancerSci，2009，100（11）：2077－2084．

4.Nangia-MakkerP，BalanV，RazA．Regulation of tumor  progression by extracellular galectin-3［J］．Cancer Microenviron，2008，1（1）：43－51．

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6.ChauhanD，LiG，PodarK，etal．A novel carbohydrate-based the rapeutic GCS-100 overcomes bortezomib resistance and enhances dexamethasone-induced apoptosis inmultiple myeloma cells［J］．CancerRes，2005，65（18）：8350－8358．

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