低分子柑橘果胶联和临床常用化疗药用于控制癌症和癌症转移扩散
申请号：201110028976.6
申请日：2011-01-27

申请(专利权)人                                     范晓青
地址                                                310003 浙江省杭州市皮市巷210号1单元103室
发明(设计)人                                   范晓青 许鹏 刘海鹰 俞仲华
主分类号                                      61K31/732(2006.01)I
分类号                                         61K31/732(2006.01)I A61K45/00(2006.01)I
                                                    A61P35/00(2006.01)I A61P1/00(2006.01)I A61P1/16(2006.01)I A61P15/00(2006.01)I A23L1/29(2006.01)I
                                                    A61K31/704(2006.01)N A61K31/664(2006.01)N
                                                    A61K31/495(2006.01)N
公开(公告)号公开(公告)日           102085214A     2011-06-08
专利代理机构                               杭州丰禾专利事务所有限公司 33214
代理人                                          王从友

(54)发明名称

低分子柑橘果胶联和临床常用化疗药用于控制癌症和癌症转移扩散

(57)摘要

本发明涉及一种低分子柑橘果胶的新用途，尤其涉及低分子柑橘果胶用于制备药品、食品或保健品的应用，该药品、食品或保健品用于联和临 床常用化疗药用于控制癌症和癌症的转移扩散。低分子柑橘果胶联和临床常用化疗药用于控制癌 症和癌症转移扩散，所述的癌症为结肠癌、肝癌或宫颈癌；所述的临床常用化疗药为PAC-1、环磷酰 胺或阿霉素。

1.低分子柑橘果胶用于制备药品的应用，其特征在于：该药品用于联和临床常用化疗药用于控制癌症和癌症的转移扩散。

2.根据权利要求1所述的低分子柑橘果-阿霉素胶用于制备药品的应用，其特征在于：癌症为结肠癌、肝癌或宫颈癌。

3.根据权利要求2所述的低分子柑橘果-阿霉素胶用于制备药品的应用，其特征在于：临床常用化疗药为PAC-1、磷酸酰胺或阿霉素。

4.低分子柑橘果胶用于制备食品的应用，其特征在于：该食品用于联和临床常用化疗药用于控制癌症和癌症的转移扩散。

5.根据权利要求4所述的低分子柑橘果胶用于制备食品的应用，其特征在于：其特征在于：癌症为结肠癌、肝癌或宫颈癌。

6.根据权利要求5所述的低分子柑橘果胶用于制备食品的应用，其特征在于：临床常 用化疗药为PAC-1、磷酸酰胺或阿霉素。

7.低分子柑橘果胶用于制备保健品的应用，其特征在于：该保健品用于联和临床常用化疗药用于用于控制癌症和癌症的转移扩散。

8.根据权利要求7所述的低分子柑橘果胶用于制备保健品的应用，其特征在于：癌症为结肠癌、肝癌或宫颈癌。

9.根据权利要求8所述的低分子柑橘果胶用于制备保健品的应用，其特征在于：临床常用化疗药为PAC-1、磷酸酰胺或阿霉素。

                                                                      低分子柑橘果胶联和临床常用化疗药用于控制癌症和癌症转移扩散

技术领域[0001] 本发明涉及一种低分子柑橘果胶的新用途，尤其涉及低分子柑橘果胶用于制备药品、食品或保健品的应用，该药品、食品或保健品用于联和临床常用化疗药用于控制癌症和癌症的转移扩散。

背景技术[0002]天然柑橘果胶是一种多糖复合物（长链碳水化合物），也是一种膳食纤维。它由天然柑橘水果如柠檬、柚子、桔子和桔的果皮和果肉中提取获得。这种多聚糖的长链产物有许 多分枝，具有粘附功能。天然果胶是可溶性纤维，食用后不能被肠道吸收。尽管有一些在大肠内发酵，但天然柑橘果胶一般对于人体没有非常有效的功用。

[0003] 低分子柑橘果胶，其结构式如下：

[0004]低分子柑橘果胶是从天然果胶产物中提取得到的一种以半乳糖为主要成份的多糖，分子量小,无抗原性，水溶性好，容易被胃肠道吸收而进入血液循环。处理后的果胶分子量明显小于天然果胶,分子结构也因甲基减少得到改变。它具有与恶性表型细胞亲和，粘附特性，特异地杀伤已突变细胞的功能，使突变细胞在未形成之前即被清除。

[0005]申请人申请了专利名称为：低分子柑橘果胶用于增强免疫功能的应用（专利申请号为200610050803.3）公开了低分子柑橘果胶能明显改善食欲，增加免疫功能和调节免疫紊乱；能降低胆固醇预防动脉粥样硬化。

[0006]专利名称为：低分子柑橘果胶用于调节血糖血脂和改善脂肪肝中的应用 （200610051667.X）公开了低分子柑橘果胶可延缓糖和脂肪在消化道内的吸收，影响胆酸的代谢，间接改变了脂质代谢酶的活性，还能促进糖和脂肪在体内的代谢，从而降低血糖和血 脂，在吸收而进入血液循环后，能在体内促进肝脏及其它器官中的糖和脂肪分解酶的活性，并降低肝脏及其它器官中的糖和脂肪合成酶的活性，从而达到降低血糖和血脂、治疗糖尿病和脂肪肝的目的。

[0007]但是对于低分子柑橘果胶用于控制癌症和转移扩散的应用还未有公开报道。

发明内容[0008]为了解决结肠癌治疗临床上常用的化疗药的耐药及其毒副作用的技术难题，本发明一个目的是的目的是提供低分子柑橘果胶的新应用。

[0009]为了实现上述的目的，本发明采用以下的技术方案。

[0010]低分子柑橘果胶用于制备药品的应用，该药品用于联和临床常用化疗药用于控制癌症和癌症的转移扩散。作为优选，所述的癌症为结肠癌、肝癌或宫颈癌。作为优选，所述 的临床常用化疗药为PAC-1、环磷酰胺或阿霉素。

 [0011]低分子柑橘果胶用于制备食品的应用，该食品用于联和临床常用化疗药用于控制癌症和癌症的转移扩散。作为优选，所述的癌症为结肠癌、肝癌或宫颈癌。作为优选，所述 的临床常用化疗药为PAC-1、环磷酰胺或阿霉素。

[0012] 低分子柑橘果胶用于制备保健品的应用，该保健品用于联和临床常用化疗药用于用于控制癌症和癌症的转移扩散。作为优选，所述的癌症为结肠癌、肝癌或宫颈癌。作为优选，所述的临床常用化疗药为PAC-1、环磷酰胺或阿霉素。

[0013]柑橘果胶是一种从柑橘类植物中提取的、以半乳糖为主要单体、具有分支结构的多糖,存在于植物细胞壁中，连接相邻的细胞。几乎所有的植物中都含有果胶成分，但苹 果，柑橘等水果中的含量尤为丰富。低分子柑橘果胶(LCP)是通过特定pH和温度，酶解CP 而获得的一种分子量更小、酯化度更低、无分支的果胶多糖。LCP是天然存在的生物信号，是一种类似激素的物质，已经被证明具有很明显的免疫调节功能，可以激活免疫系统中的白细胞，NK细胞，吞噬细胞等。然而研究发现CP不能与Galectin-3相互作用,但LCP则是Galectin-3的一个配体且具有极强的亲和力。因此，LCP可以作为体内Galectin-3配体的竞争性抑制剂。研究证实，当体内LCP达到一定浓度时，癌细胞的Galectin-3只与LCP发生反应，而不再与其配体结合，从而抑制了Galectin-3的功能表达，继而阻止了肿瘤的形成。另一方面，对已经形成的肿瘤，LCP也可通过将肿瘤细胞表面Galectin-3位点完全封闭而阻止肿瘤细胞从血管获得营养，抑制其生长、转移,实验表明LCP在一定浓度内能抑制肿瘤生长和肝转移出现，并呈量效依赖关系。高浓度LCP能有效抑制小鼠结肠癌的原位生长、肝转移灶的形成。体外实验证明,LCP具有抑制肿瘤细胞的同型聚集作用,能抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞与内皮细胞的粘附作用。

附图说明[0014]图1为不同浓度PAC-1对人结肠癌细胞作用72小时的MTT结果图。

[0015]图2为不同浓度PAC-1处理细胞24h后细胞形态的变化图。

[0016]图3为PAC-1与LCP联合应用对细胞增殖的影响图。

[0017]图4为IC50浓度的PAC-1单药及联合低分子柑橘果胶处理SW116细胞不同时间后的凋亡比例。

[0018]图5为IC50浓度的PAC-1单药及联合低分子柑橘果胶处理SW620细胞不同时间后的凋亡比例。

[0019]图6为不同浓度的PAC-1单药及联合低分子柑橘果胶处理SW116细胞48h后细胞的凋亡比例。

[0020]图7为不同浓度的PAC-1单药及联合低分子柑橘果胶处理SW620细胞48h后细胞的凋亡比例。

[0021]图8为为同浓度PAC-1单用及联合低分子柑橘果胶处理SW116细胞不同时间后细胞周期变化图。

[0022]图9为PAC-1单用及联合LCP处理SW116细胞后凋亡相关蛋白表达的变化图。

具体实施方式

[0023] 实施例1   结肠癌是一种常见的恶性肿瘤,细胞转移是恶性肿瘤的重要特征,肝脏是结肠癌转移最常累及的器官。除手术治疗外，内科治疗在结肠癌的治疗中起重要作用。但以目前临床上的治疗效果来看，临床上常用的化疗药的耐药及其毒副作用已成为结肠癌治疗的难题。

[0024] 结肠癌的生长及转移是一个复杂的过程:与细胞分化异常、增值异常、生长失常、癌细胞的生物学特性、机体免疫状况及肝脏的微环境有关，每一个步骤都涉及多种分子事件，对这些分子事件的了解将为结肠癌及其肝转移灶的预防和治疗提供理论依据。在这些机制中凋亡调控机制失常而发生凋亡受阻对癌细胞增值、转移有关键作用。

[0025]结肠癌分子靶向治疗主要分类：(1)针对表皮生长因子受体(EGFR)通道的靶向治疗：如西妥昔单抗(cetuximab)；(2)针对血管内皮生长因子(VEGF)及其受体通道的靶向治疗：如贝伐单抗(Avastin)；(3)针对其他分子靶点：如caspase凋亡通路的靶向治疗、RAS信号通道的靶向治疗、基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂和选择性环氧化酶2(COX-2)抑制剂等。

[0026]因此，本发明以诱导癌细胞凋亡为切入点，通过体内、体外实验，探讨从柑橘中提取的低分子柑橘果胶来验证抑制肿瘤细胞生长的机制。

[0027]本实施例采用PAC-1联合LCP对结肠癌细胞的协同杀伤作用及其分子机制研究，有助于日后全面认识在诱导细胞凋亡中的地位和意义。

[0028]半胱天冬酶原活化复合物-1（procaspase-activatingcompound-1，PAC-1）是2006年美国伊利诺伊大学P.J.Hergenrother教授领导的研究小组通过筛选25000 多种物质后发现的一种小分子复合物，它能高效活化半胱天冬酶原-3（procaspase-3）转化为半胱天冬酶（caspase-3）并诱细胞产生凋亡。

[0029]的化学结构  分子式为:C23H28N4O2，分子量为:392.5。

[0030]

[0031]对结肠癌细胞凋亡和增殖的影响

如图1所示，PAC-1单用对研究的5种人结肠癌细胞株均表现出明显的抗肿瘤活性，不同的人结肠癌细胞株对PAC-1的敏感性存在不同（3-22.7uM），与文献报道相符。

[0032]PAC-1处理细胞12h后caspase-3表达开始升高，同时PARP及Rock-1的表达也开始升高，各蛋白表达的变化均呈时间依赖性。caspase-8、9的表达随时间的变化不明显变化。表明PAC-1直接作用于凋亡途径下游的凋亡关键执行蛋白caspase-3，与文献报道相符。

[0033] PAC-1作用前后，随浓度增加细胞增殖周期G0／G1期细胞增加，G2／M、S期细胞减少，具有时间依赖性。说明药物作用后细胞G1期延长，不增殖细胞群即G1期细胞增多，而G1期延长意味着细胞增殖周期延长，增殖缓慢。

[0034] PAC-1可以通过诱导结肠癌细胞凋亡和抑制结肠癌细胞增殖两条途径发挥其抗肿瘤作用。

[0035]联合LCP对结肠癌细胞生长的影响

目前通过细胞和动物模型实验，证实LCP对黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌和结肠癌等有生长抑制作用。

[0036] 1、在人结肠癌细胞中LCP与中高浓度的PAC-1联合应用起协同作用（CI＜1），联合用药组的人结肠癌细胞的凋亡比例较PAC-1单用显著增加，表明LCP一方面可以抑制 肿瘤细胞生长，另一方面还能增强小分子靶向复合物PAC-1对人结肠癌细胞的诱导凋亡作用。

[0037] 2、LCP联合PAC-1较PAC-1单用可更有效的使细胞周期调控失衡，使更多的人结肠癌细胞停留在G0／G1期，G2／M、S期细胞减少，且具有时间依赖性，说明LCP可以延长细胞的增殖周期。

[0038]3、LCP联合PAC-1处理细胞后：Bcl-2蛋白表达变化不明显，Bax蛋白表达增高，Bax/Bcl-2比值升高，提示LCP增强PAC-1诱导人结肠癌细胞凋亡的机制可能与调控这两种蛋白表达、降低细胞的凋亡抗性有关。

[0039]LCP联合PAC-1处理细胞后较相同浓度相同时间的PAC-1单用caspase-3、表达及下游ROCK-1和PARP的裂解显著增加，caspase-8蛋白表达的无明显变化，表明线粒体通路在LCP联合PAC-1协同杀伤人结肠癌细胞的分子机制中发挥重要作用。

[0040]一、PAC-1对人结肠癌细胞的的生长抑制作用，如图1所示表1-1显示了不同浓度PAC-1对人结肠癌细胞作用72小时的MTT结果，(单位：umol/L)

 [0041]二、不同浓度PAC-1处理细胞24h后细胞形态的变化，如图2所示。

[0042]三、PAC-1与LCP联合应用对细胞增殖的影响 如图3所示，低浓度的PAC-1与LCP联合起拮抗作用CI＞1；中、高浓度的PAC-1与LCP 联合起协同作用CI＜1。

[0043]四、PAC-1单用及联合LCP处理细胞后细胞凋亡比例的变化 图4为IC50浓度的PAC-1单药及联合低分子柑橘果胶处理SW116细胞不同时间后的凋亡比例；

图5为IC50浓度的PAC-1单药及联合低分子柑橘果胶处理SW620细胞不同时间后的凋亡比例；

图6为不同浓度的PAC-1单药及联合低分子柑橘果胶处理SW116细胞48h后细胞的凋亡比例；

图7为不同浓度的PAC-1单药及联合低分子柑橘果胶处理SW620细胞48h后细胞的凋亡比例。

[0044] 五、PAC-1单用及联合LCP处理细胞后细胞周期的变化

图8为同浓度PAC-1单用及联合低分子柑橘果胶处理SW116细胞不同时间后细胞周期变化；

表1-2为不同浓度PAC-1处理细胞24h后细胞周期变化； 表1-3为不同浓度PAC-1联合LCP处理细胞24h后细胞周期变化。

[0045]表1-2不同浓度PAC-1处理细胞24h后细胞周期变化

表1-3不同浓度PAC-1联合LCP处理细胞24h后细胞周期变化。

[0046] 六、PAC-1单用及联合LCP作用SW116和SW620细胞后凋亡关键蛋白caspase-3、8、9、PARP、Rock-1的蛋白表达水平的情况

图9显示了PAC-1单用及联合LCP处理SW116细胞后凋亡相关蛋白表达的变化。

[0047]综上所示 

1、PAC-1对实验的5种人结肠癌细胞均表现出明显的增殖抑制和诱导凋亡

2、PAC-1联合LCP对人结肠癌细胞起协同杀伤作用；

3、PAC-1可以直接高效活化caspase-3；

4、线粒体途径是PAC-1联合LCP协同诱导人结肠癌细胞凋亡的机制；

5、PAC-1单用及联合LCP可延长细胞的增殖周期。

[0048]LCP-对小鼠肝癌H22瘤株的抑制作用，CY为环磷酰胺。

[0049]实验其间各组小鼠食水，毛色，活动状态正常。小鼠接种H22细胞后五天，各组均可触及皮下肿瘤，试验其间LCP各给药组小鼠活动状态正常。第10天处死动物，解剖时发现，与NS组比较，LCP各组肿瘤浸润范围较小，深度局限，瘤体易剥离。LCP与CY联合应用肿瘤抑制率明显高于各组，具有统计学意义(P<0.001)用LCP各组小鼠体重与NS组比较无明显差异，单CY组小鼠体重与NS组比较明显低，进一表明LCP不具有毒性。与CY联用减少毒性。

[0050]实验结果表明：LCP对肿瘤生长的抑制作用呈剂量依赖关系，LCP与CY联合应用肿瘤抑制率明显高于各组，具有统计学意义(P<0.01)。

[0051]LCP-对小鼠宫颈癌U14瘤株的抑制作用，DOX为阿霉素。

[0052]试验其间各组小鼠食水，毛色，活动状态正常。小鼠接U14后细胞8天，给药10天处死动物，解剖并计算抑瘤率，与NS组比较，LCP各组肿瘤浸润范围较小，深度局限，瘤体易剥离。LCP与DOX联合应用肿瘤抑制率明显高于各组，具有统计学意义(P<0.01)。

[0053]实验结果表明：LCP对肿瘤生长的抑制作用呈剂量依赖关系，LCP与DOX联合应用肿瘤抑制率明显高于各组，具有统计学意义(P<0.01)。