通过口服改性柑橘果胶抑制人类癌细胞的生长和裸鼠体内的转移

作者：Pratima Nangia-Makker, Victor Hogan, Yuichiro Honjo, Sara Baccarini, Larry Tait, Robert Bresalier, Avraham Raz                       译者：Tiffany Yang

美国《国家癌症研究所》期刊，94卷，第24号，2002年12月18日          

背景：膳食成分在癌症进展和转移中的作用是一个有着重要临床意义的新兴领域。许多癌症的发展阶段都涉及碳水化合物介导的识别过程。因此，我们研究了高pH值和调整温度下柑橘果胶（MCP）的作用，一种不易消化的，水溶性的源于柑橘类水果的多糖纤维，抑制碳水化合物结合蛋白galectin-3在体内的的肿瘤生长和转移，以及体外的半乳糖凝集素-3-介导功能。

方法：将裸鼠通过饮用水喂入MCP，同时在体内注射人类乳腺癌细胞（MDA-MB-435）到乳腺脂肪垫区域或者注射人结肠癌细胞（LSLiM6）进入盲肠，然后研究体内的肿瘤生长，血管生成以及转移。通过评估MCP通过基底膜中人脐静脉内皮细胞（HUVEC）对于毛细血管形成的效用，可以研究半乳糖凝集素-3-介导在体内肿瘤血管生成过程中的功能。MCP对半乳糖凝集素-3-诱导人脐静脉内皮细胞趋化的影响和对体外人脐静脉内皮细胞MDA-MB-435细胞粘合物的影响可以分别用Boyden小室和标签检测的方法来研究。数据由两派学术研究：t检验或费雪的保护最小显著区别检验。结果：小鼠被喂食MCP后体内肿瘤生长，血管生成和自发转移的情况显着降低。服用一定剂量的MCP抑制了人脐静脉内皮细胞的形态（毛细管形成）。同时MCP抑制了半乳糖凝集素-3与内皮细胞的结合：在0.1％和0.25％的浓度下，MCP分别抑制了半乳糖凝集素-3（10微克/毫升）与72.1％（P = 0.038）和95.8％（p =.025）的内皮细胞的结合。在0.25％的浓度下，MCP抑制了半乳糖凝集素-3（1微克/毫升）与100％（p = .032）内皮细胞的结合。 在一定剂量下MCP抑制血管内皮细胞趋向半乳糖凝集素-3，在0.005％（P <0.001）时减少68％，在0.1％（P <0.001）时完全抑制。最后， MCP还抑制了MDA-MB-435细胞的粘附，它在一定剂量下将半乳糖凝集素-3暴露于内皮细胞。结论：通过对半乳糖凝集素-3的影响，口服MCP能抑制体内碳水化合物介导肿瘤的生长，血管生成和转移。这些数据强调了碳水化合物饮食在预防或治疗癌症中的重要性。

碳水化合物在生物信息编码上有巨大的潜力。所有的细胞在其表面用糖蛋白，糖脂，多糖的形式表达碳水化合物。凝集素，糖类结合蛋白，不仅可以区分不同的单糖，而且还专门绑定低聚糖，检测复杂的碳水化合物结构中的细微差别（1）。持续的增长和随后的癌症转移依赖于肿瘤血管，碳水化合物介导识别相互作用也在血管新生中发挥作用（2）。凝集素的可溶性形式（例如，E-选择素，血管细胞粘附分子-1 [VCAM] -1和P-选择素）在结合各自的糖缀合物配合基后可以促进内皮细胞迁移和形态改变（3）。

癌症患者血清中的E-选择素浓度升高的临床表现为这些分子在癌症进展中的重要性提供体内的证据。然而，这个前提被一份显示E-和P-选择素缺陷小鼠能够诱导正常的血管生成的报告质疑（8）。因此，我们提前调查另一个可溶性糖结合凝集素，即半乳糖凝集素-3，是否可以提供一种替代的血管通路和显示依赖碳水化合物的半乳糖凝集素-3结合内皮细胞，诱导体内内皮细胞形态和体外血管生成（9）。 半乳糖凝集素-3的所属的半乳糖凝集素蛋白质家族，被定义为一个共同的碳水化合物结合域和亲和力半乳糖保守序列（10）。

半乳糖凝集素-3的一个显着特点是其在肿瘤改造和癌症发展中的意义。半乳糖凝集素-3的水平和肿瘤进展阶段间有一个直接的关系。此外，从实验上来说，半乳糖凝集素-3的单克隆抗体强烈抑制了实验中肺部B16黑色素瘤的和UV-2237纤维肉瘤细胞的转移（13）。合成glycoamines FRU-DLeu和紫胶-L-亮氨酸可以作为裸鼠中人乳腺癌癌症自发转移的有效抑制剂（14），D-半乳糖和阿拉伯半乳聚糖可以大大抑制L-1实验性肉瘤细胞肝转移的形成（15）。最近，据报道，反半乳糖凝集素-3的抗体和乳糖能通过腺癌细胞株XK4A3和RPMI4788抑制肝转移（16）。这些研究表明了碳水化合物在介导肿瘤治疗中的潜力。

果胶是一个非常复杂分支的多糖，在半乳糖苷残留物中富含纤维，而现今也存在于所有植物细胞壁中。最初据报道当pH值从酸性到碱性变化时它结合致癌物质1,2  - 二甲肼（DMH）的效率也越来越高（17）。在其原本的形式下，柑橘果胶（CP）在水中的溶解度有限，无法交互半乳糖凝集素-3，但其改良的形式（MCP）在水解后形成一个较小的线性水溶性纤维，，它作为一个半乳糖凝集素-3的配基（18-20）。将黑色素瘤B16-F1细胞注射入MCP治疗的小鼠体内会导致肺定植的显着减少（19）。此外，注射了前列腺癌症细胞株MAT-LyLu的哥本哈根雄性大鼠在口服一定剂量的MCP后减少了自发性肺定植的情况（18），这表明MCP干扰了循环中半乳糖凝集素-3-依赖性肿瘤的栓塞，导致转移的减少（18,19）。口服MCP后小鼠植入结肠肿瘤生长减缓的事实已被证实（21）。谢与吴（22）最近报道，MCP治疗能减缓人类前列腺JCA-1细胞的成长和DNA的合成，同时伴随着细胞周期蛋白B，nm23 ，P34和CDC2的降低，不易消化的膳食，不溶于水的糖类纤维在在各种人类癌症的病因中有着可观的作用，因为他们作为化学预防剂对预防癌症有重要意义。从实验室（18-20）和其他（22-26）的数据已经表明，碳水化合物饮食能抑制在小鼠实验性肿瘤系统中肿瘤的生长和转移。在这里，我们研究体外MCP对半乳糖凝集素-3-介导功能的作用和对裸鼠体内的血管生成，肿瘤生长和转移的作用。

材料与方法

细胞株和文化

从美国菌种保藏中心（ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州）购买了人脐静脉内皮细胞（内皮细胞）。转移性人乳腺癌细胞株MDA-MB-435是由埃里克·W·汤普森博士赠送的（圣Vincentâ医学研究和墨尔本大学研究所，墨尔本，澳大利亚）。 LSLiM6是一个很有特点的从低转移性LS174T衍生出来的转移性结肠腺癌细胞系（27,28）。内皮细胞在哈马的F12K培养基（欧文科学，加利福尼亚州欧文）中培育出来，辅以100克/毫升肝素（西格玛化工有限公司，圣路易斯，密苏里州），50克/毫升内皮细胞生长添加剂（协同生物医药产品，贝德福德，硕士），10％胎牛血清（FBS的;首脑会议生物技术，柯林斯堡，一氧化碳）。 MDA-MB-435 和LSLiM6细胞保存在含10％热灭活胎牛血清（FCS）必要的和不必要的氨基酸（Invitrogen公司），维生素，抗生素（敏达公司，赫恩登，VA）的Dulbeccoâ的极小基底介质中（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA）。

    细胞保持在有95％的空气和5％的二氧化碳的温度为37°C的加湿室。细胞生长汇合，然后从2毫米EDTA和0.25％单层胰蛋白酶分离。细胞株的运用得到了人力调查委员会，韦恩州立大学（底特律，MI）的批准。

为收集条件培养基，细胞接种至一个60毫米碟子的汇合处。 24小时后培养基移除，细胞用phosphatebuffered洗涤液（PBS）彻底洗涤，允许在无血清培养基中生长。24小时后培养基被收集起来，通过10K分子量被剔除的Ultrafree-MC离心过滤单位（Millipore公司，贝德福德，马萨诸塞）来离心分离从而浓缩了20倍，通过西方blot分析来分析半乳糖凝集素-3的存在。

重组半乳糖凝集素-3的制备和改良柑橘果胶

重组人类半乳糖凝集素-3表现在大肠杆菌中，被亲和层析柱用前面描述的无唾液酸胎球蛋白柱分离（29）。 柑橘果胶购买自Sigma公司; pH值和温度的改良如描述（19）。简言之，柑橘果胶被溶解成含1.5％柑橘果胶的蒸馏水溶液，其pH增至10.0，伴着NaOH（3N）放在50-60°C一小时。然后把溶液冷却到室温，用3N HCI把它的pH值调整至3.0，储存过夜。第二天样本用95％的乙醇沉淀，温育在-20°C 2小时，过滤，用丙酮洗涤，用滤纸过滤器烘干。对于裸鼠喂食，1％的MCP溶液融入灭菌水中，其pH值调整到约7.0，溶液（500毫升）使用马克伽马射线1-68辐照（JL牧羊人＆Associates的格伦代尔，加利福尼亚）以552拉德/分钟的频率消毒照射45分钟。

CP和MCP的成分分析

乔治亚大学（雅典）的复杂碳水化合物研究中心进行了成分分析。

样品水解使用新鲜配制1 M盐酸和3％甲醇，放置在80°C的环境下16小时。释放出的糖被干燥，N-乙酰在45°C使用甲醇和醋酐15分钟，乙酰样本为三甲基唾液酸与三银试剂（皮尔斯，罗克福德，IL）

并用15985 GC-MS系统（惠普，帕洛阿尔托，CA）解析于30-m DB-1柱（J＆W科学，福尔瑟姆，加利福尼亚州），使用肌醇作为内部标准。

肿瘤的生长和转移

NCR nu / nu小鼠乳腺脂肪垫区域被注射了7.5*105个MDA-MB-435细胞。该区域，接种时间和尸检都用价格描述（30）。在开始注射肿瘤细胞前1周两组小鼠，每组10只，分别在引用水中添加1％（W / V）的MCP（pH值约为7.0）。两个对照组，每组10只小鼠均保持正常的蒸压用水。其中一组喂食MCP的对照组，肿瘤测定每周两次，持续了7周，体积用公式计算（长*宽度1 *宽度2*0.5）。 51天之后，老鼠被麻醉（使用氯胺酮[70毫克/公斤体重]）和甲苯噻嗪[7.5毫克/千克体重]），原发肿瘤用手术移除，因为其中一些大于1.5厘米。小鼠继续喂食水或者说MCP溶液8个礼拜，之后他们因为颈椎脱位而死亡。 他们的肺被移除，用Bouinâ固定液固定，使用视觉和微观观察肿瘤细胞集落的形成。

第二组用MCP喂养的小鼠在33天时被处死。肿瘤被移除，称重，在PBS中用10％的福尔马林固定，并将血管用免疫组化染色处理。在33天时肿瘤被移除，因为有些肿瘤在稍后阶段坏死。

MCP抑制人类结肠癌细胞从盲肠到肝脏自发转移的能力如先前所描述的进行了测试（28）。我们选择了结肠腺癌细胞株LSLiM6，因为这些细胞在裸鼠脾门静脉注射后在盲肠的生长中表现出了很高的肝转移和高肝定植能力（27）。这些细胞也产生高级别的细胞内和细胞表面的半乳糖凝集素-3（28）。 在一组10只无病原体裸鼠的饮用水中喂食1％的MCP一周时间，他们通过吸入甲氧被麻醉，盲肠被形象化，0.1毫升中5×106的可行LSLiM6细胞被注入盲肠壁。盲肠原位替换，腹部用不锈钢片封闭。 6周后，处死动物，盲肠，腹部肿块，和肝脏被移除。有宏观肝癌结节的动物数量被测定和比较，对照组动物给予白开水。所有程序的进行都是与韦恩州立大学动物调查委员会提供的指引相一致的。所有的老鼠都进行每天检查，对照和治疗的小鼠的体重或行为方面没有区别。

通过免疫组化分析使血可视化

原发肿瘤的毛细血管

为了使从对照组切除的用MCP喂养的小鼠中原发肿瘤的血管可视化，这些部分用α平滑肌肌动蛋白染色，沾染平滑肌细胞的血管。免疫组化使用改良的avidin-biotin-过氧化物酶复合物技术。简单地说，4-μm的组织切片脱蜡，复水，放置在3％的双氧水中，以抑制内源性过氧化物酶。组织切片用0.1％的胰蛋白酶和0.1％的氯化钙进行处理，放置于37°C 3 0分钟，以暴露被福尔马林固定屏蔽处的抗原，用3％正常山羊血清封闭1小时（Sigma化学公司），随后1：100稀释，与单克隆鼠抗人体α-平滑肌肌动蛋白一起放置过夜（DAKO公司，Carpinteria，CA）。然后在室温用生物素标记的第二抗体处理30分钟（Vectastain精英ABC试剂盒;媒介实验室，伯林盖姆，加利福尼亚州），之后使用亲和生物素标记的辣根过氧化物酶（HRP）的复杂试剂（根据的制造商的指示）30分钟，再用二氨基联苯胺（西格玛化工有限公司）1分钟。用苏木进行对比染色。

内皮细胞的毛细管形成

内皮细胞的毛细管形成按照前面所述的方法用基底膜检测（协同生物医药产品，贝德福德，马萨诸塞州）（9）。为了准备凝胶，把200μL的基底膜放在冰上解冻，并添加到八室幻灯片的每个室中。气泡小心被移除，幻灯片被转移到37°C孵化器中15分钟。做成凝胶之后，5 *104内皮细胞胰蛋白酶疗法将单层膜分离，并掺200μL培养基接种到凝胶中。在一些室中，将MCP或CP在孵化时添加到细胞。血管形成后，观察16个小时。

血管内皮细胞对半乳糖凝集素-3的趋化反应

半乳糖凝集素-3-诱导对内皮细胞的趋化反应用Boyden小室分析。简单地说，30 μL的无血清F12K培养基，含10μ克/毫升半乳糖凝集素-3的存在或者没有不同浓度的MCP被添加到作为趋化因子的下腔。血管内皮细胞（5×104）被添加到上腔。两腔被聚碳酸酯过滤器（8 - μm孔径）分离，孵育在37°C。 5小时后，连接到过滤器较低表面的细胞使用赫马3染色集“议定书” （Fisher科技公司，宾夕法尼亚州匹兹堡） 被固定和染色。取自每个小室的总共10个领域的细胞在显微镜下计数，每个领域的平均细胞数被绘制。每个检测都一式四份。为了调查MCP抑制​​趋化的特殊性，使用采用纤维连接蛋白和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）诱导趋化进行比较评价。

重组半乳凝素-3的生物素

重组半乳凝素-3是从转化细菌分离来的，并如前所述纯化（29）。蛋白质根据制造商的指示使用EZ-Link的磺酸基-NHS-生物素包（皮尔斯）生物素化。简单地说，蛋白质溶液集中在2毫克/毫升PBS中并混合成30微升磺酸基-NHS-生物素（2毫克/100微升水），从而得到摩尔比为1：20。生物素是由混合物放在冰上培育2小时得到的。把过量的盐通过脱盐列的蛋白质溶液从而被移除。馏分收集，确定每个蛋白质的分数含量。

半乳糖凝集素-3-内皮细胞的结合分析

内皮细胞以1×104细胞/孔的密度接种在96孔的板上。 24小时后，细胞用PBS洗四次，与不同浓度的MCP一起培养，放在在37°C 100微升无血清F12K培养基中15分钟。经过培育，不同浓度的生物素化重组半乳糖凝集素-3被添加到孔中，于37°C培养2个小时。用PBS仔细的清洗小孔3次。下一步，100微升1：1000稀释的HRP-标记的链霉添加到小孔中在室温培养30分钟。用PBS洗涤三次把未绑定的蛋白质移除。使用100微升柠檬酸缓冲液混合ABTS（2,2 azino-di [3 ethylbenzthiazoline]磺酸）和过氧化氢来展色，在波长为405纳米的情况下酶联免疫吸附试验（ELISA）测定检测酶标仪（分子器件，桑尼维尔，CA）。

间接免疫荧光法检测肿瘤细胞的半乳糖凝集素-3

MDA-MB-435细胞胰酶消化并以密度50000个细胞/室接种在一个四室的幻灯片中。经过24小时，细胞在室温下与3.4％多聚甲醛固定15分钟，用含有1％的牛血清白蛋白（BSA）的PBS洗四次。细胞用含1％BSA的PBS封锁30分钟，以1：1稀释，PBS中含1％BSA之后用原发性抗体放置4℃培养1小时（TIB-166大鼠反半乳糖凝集素3单克隆抗体; ATCC）。随后，细胞用含0.1％BSA的PBS清洗三次，并以1：50稀释，用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG抗体; Zymed，旧金山，加利福尼亚州）培育30分钟。初级抗体被省略。该小室脱落幻灯片，细胞安装在gelvatol（13％W / V聚乙烯醇-2000，0.6×PBS，30％甘油），在荧光显微镜（奥林巴斯，日本东京）下观察半乳糖凝集素-3的存在。

半乳糖凝集素-3的免疫印迹分析

为了研究半乳糖凝集素3的表达式，将血管内皮细胞或MDAMB-

435细胞胰酶消化，并与台盼蓝混合。活细胞以血球计数，细胞被冻结在样品缓冲液中（0.76％磷酸三，10％的甘油，1％十二烷基硫酸钠[SDS]，1％2 - 巯基乙醇，1％溴酚蓝），5000细胞/微升。要研究半乳糖凝集素-3的分泌，条件培养基如“细胞链和文化”一节中所述进行了收集和集中。每个小道含相等的蛋白量（50微克）或溶解细胞（1×105）。蛋白质用12.5％的聚丙烯酰胺分离胶和3.5％的浓缩胶分离，并electroblotted到polyvinylpyrrolidine氟乙烯（PVDF）细胞膜（微星，韦斯特伯鲁，马萨诸塞州）中。非特异性约束力被封锁在5％的PBS脱脂干奶1小时，其次与第一抗体（大鼠的单克隆抗-半乳糖凝集素-3或多克隆-反半乳糖凝集素-3抗体）在室温下一起培养1小时。

随后，将细胞膜与含0.1％吐温20的封闭液洗涤五次，并与二抗（分别HRP标记的兔抗鼠IgG或山羊抗兔IgG， Zymed）培育 1小时。如之前一般洗涤后，他们采用电化学发光免疫印迹检测试剂（Amersham公司，皮斯卡塔韦新泽西州）进行了增强化学发光处理，根据制造商的说明找到半乳糖凝集素-3的蛋白。

肿瘤内皮细胞粘附检测

MDA-MB-435细胞用含1％BSA的无血清介质在3×106细胞/毫升的浓度下被冻结，并用5 μCi的Na51CrO4 CI（杜邦松嫩，波士顿，马萨诸塞州）放射性标记，置于37°C 2小时。培养末期，细胞悬浮液被广泛清洗，一式四份接种在16毫米的含人脐静脉内皮细胞单层的COSTAR培养皿中（康宁，剑桥），含有或不含不同浓度（0.01％，0.05％，0.1％，或0.25％）的MCP。 2小时后，细胞用PBS彻底地洗净，贴壁细胞用0.1N氢氧化钠裂解（30分钟，37°C）。要确定MDA-MB-435细胞粘附内皮细胞的百分比，细胞相关的放射性由Packard自动伽玛计数器测定（型号5650;惠普生物科技有限公司/Perkin Elmer公司， IL）。在无MCP控制实验中肿瘤细胞对内皮细胞的粘附度为100％;存在MCP的实验中附着力相应的计算。

统计分析

肿瘤的生长，趋化，在体内的血管生成，和绑定能力是被测量的主要成果。数据由两个或三个置信区间（CI）在95％的实验提供。 （实验都通过不同动物重复进行两次以测定肿瘤的生长。）我们使用学生的t检验或Fisher的保护最小显着差异检验（PLSD），使用StatView软件（Abacus概念，大学伯克利分校，加利福尼亚州）来分析结果的统计学意义。所有的统计双面检验，P值小于0.05被认为是有统计学意义的。

结论

要测试MCP抑制肿瘤生长和转移的能力，7.5×105 MDA-MB-435人乳腺癌细胞被注入一个星期前开始通过饮用水喂食1％MCP的NCR小鼠乳腺脂肪垫。溶液的pH值调整到7.0以中和MCP酸味。整个实验期间连续饲喂小鼠MCP。MCP添加到饮用水没有影响整体致瘤效率。然而，对照与组小鼠（p =.050，学生的t检验;图1）相比，喂食MCP的老鼠肿瘤生长速度显著减缓。肿瘤接种7个星期后，对照组小鼠的肿瘤达到1.5厘米，迫使我们终止对所有小鼠的分析。对照组平均肿瘤体积为552±14mm3（95％CI=540至564 mm3），对比MCP喂养小鼠的165±48 mm3（95％CI=128至201 mm3）。对照组和治疗组在肿瘤体积控制之间的差异为387mm3（95％CI=363到412 mm3）。在实验结束后15周，处死实验小鼠，尸检，并检查肿瘤转移。三只老鼠（一只对照小鼠和两只MCP喂养小鼠）在手术中或手术后立即死亡;因此，并没有分析每组全部10只小鼠的转移。喂食MCP组肺转移的数量明显比对照组小许多（分别是8只中的0只和9只中的6只）。各组的代表肺部描绘见图2。每日饮水量在各组相似。小鼠没有任何厌恶MCP的表现。治疗组动物体重和整体行为与对照组相似。

为了分析MCP是否能抑制其他类型肿瘤的增长，我们还研究了喂食MCP裸鼠的人类结肠癌细胞的结肠增长和自发转移。此前，我们已经表明，半乳糖凝集素-3对在脾脏门脉或盲肠增长后人类结肠癌细胞的肝脏定植起作用（27,28）。因此，我们检验MCP是否会影响从盲肠到肝脏这些细胞的传播，。五百万LSLiM6细胞手术植入到裸鼠盲肠（MCP喂养和对照组每组10只老鼠），6个星期后，经过不断的MCP喂养，处死小鼠，肿瘤被切除，称重，记录转移的发病率。对照组和1％（W / V）MCP喂食组原发肿瘤的平均重量分别为1.16克（95％CI-1.13至1.19克）和0.65克（95％CI为= 0.37至0.93克）。

对照组和MCP喂食组小鼠腹内的肿瘤重量分别为2.0克（95％CI=1.94至2.06 克）和0.88克（95％CI=0.37至0.93克）。对照组和治疗组原发肿瘤重量之间的区别为0.51克（95％CI=0.40至0.82克）。对照组和MCP组腹内肿瘤重量差异为1.12克（95％CI=1.01至1.69克）。对照组转移至淋巴结和肝脏的分别为100％（9只中的9只）和60％（10只中的6只），对比MCP喂食组的25％（8只中的2只）和0％（9只中的0只）。类似的结果在重复实验中观察到。所有组别中每日水的摄入量是相似的。对照组和治疗组的动物体重和整体行为不变。

以前我们已经证明，半乳糖凝集素-3介导体内内皮细胞的细胞形态和体外依赖碳水化合物生成血管（9）。因此，我们调查MCP对肿瘤生长的抑制效果是否与减少血管生成有关。生长在水或MCP喂养裸鼠（每组5只）乳腺脂肪垫中的原发MDA-MB-435肿瘤被切除，固定，染色来研究血管的存在。每单位面积MCP喂养小鼠的肿瘤是对照组小鼠肿瘤数量的三分之一（图3）。从每组提取的三个肿瘤切片，每一个幻灯片的一个领域对比每个肿瘤的三个幻灯片计数血管的生成。对比组和治疗组平均血管数（和95％CI）分别为15.0（95％CI为12.9至17.2）和4.9（95％CI为3.0至6.7）。为了直接测试MCP对血管内皮细胞形态的影响，进行了一项体外毛细管形成的测定。通过在37°C培养15分钟，八室幻灯片的每室都形成了薄薄的一层基底膜。然后把五万内皮细胞接种于各室，同时加入不同浓度的MCP或CP。观察MCP组在一定剂量下抑制细胞在基底膜建立毛细血管网络的能力（图4，B-D），同时对比对照组PBS（图4，A）和完整的CP控制（图4，E和F）。

趋化是血管生成、侵袭和转移不可分割的一部分（31）。和碱性成纤维细胞生长因子一样，半乳糖凝集素-3诱导对血管内皮细胞有趋化反应（9）。以确定MCP是否能抑制半乳糖凝集素-3-诱导对内皮细胞的趋化，我们进行Boyden小室趋化实验。作为趋化因子，在无血清培养基中的半乳糖凝集素3（10微克/毫升）含有不同浓度的MCP被放置在较低的叶片上，和血管内皮细胞（5×104个细胞）被装入上腔。经过5个小时在37°C的培养，向趋化因子迁移的细胞被固定，染色，放于相位对比显微镜下计数（图5，A）。 MCP依赖一定剂量下对抑制对半乳糖凝集素-3的趋化反应有显著作用。在浓度为0.005％（W / V）时，趋化性减少了68％。在浓度为0.1％（W / V）的时候，趋化性被完全抑制，与阴性对照组有相同数量的迁徙细胞。下一步，我们通过分析存在MCP时纤维连接蛋白和碱性成纤维细胞生长因子诱导的趋化性，调查MCP的影响是否具体到针对半乳糖凝集素-3的趋化反应。 MCP（在浓度为0.05％的时候）对纤维连接蛋白诱导的迁移有很少的抑制作用（抑制26％），可以强烈的抑制碱性成纤维细胞生长因子诱导的趋化（在浓度分别为0.01％和0.05％的时候，抑制34％和86％）（图5，B）。使用费舍尔的PLSD测试计算P值，半乳糖凝集素-3为0.016，含0.001％的MCP，或小于0.001，MCP含量分别为0.005％，0.01％和0.1％;对纤维连接蛋白来说，在MCP为0.01％和0.05％时，P值分别为0.122和.007;对于碱性成纤维细胞生长因子，在MCP分别为0.01％和0.05％时，P值分别为.015和小于0.001。

之前我们已经证实，半乳糖凝集素-3结合到内皮细胞表面的高与低亲和力受体（9），该结合专门促发内皮细胞毛细管的形成。为了确认MCP是否能抑制这种结合，1×104内皮细胞接种在96孔板并和不同浓度的MCP在37°C孵育15分钟。之后加入生物素半乳糖凝集素-3（1 微克 /毫升和10微克/毫升），在37°C培养2小时后，细胞被彻底清洗，结合的效率是由ABTS和H2O2的颜色发展决定的。结果（图6）表明，galectin-3会结合内皮细胞，而MCP专门抑制这种结合。类似的实验分别用CP，乳糖，蔗糖操作;抑制只发生于乳糖和MCP，蔗糖或CP没有发生（数据未显示）。在MCP浓度为0.1％和0.25％时，10 μg / mL的半乳糖凝集素-3与血管内皮细胞的结合分别被抑制了72.1％和95.8％，当MCP 浓度为0.25％时，1μg / mL的半乳糖凝集素-3与血管内皮细胞的结合被100％抑制。（当MCP浓度为0.1％和0.25％，1 μg / mL galectin-3浓度时，使用费舍尔的PLSD测试的P值分别为0.045和0.032。当MCP浓度为0.1％和0.25％，10 μg / mL 半乳糖凝集素-3浓度时， P值分别为0.038和0.025）。西方杂交和直接免疫荧光分析表明，MDA-MB-435细胞能表达细胞表面上和细胞质里的半乳糖凝集素-3，并分泌它（图7）。随着MCP剂量的增加，如分别为0.01％，0.05％，0.1％和0.25％，MCP对肿瘤细胞与内皮细胞结合（附着力）的抑制有一个渐进的作用（33％，58.4％，66.5％和83.4％）（图8）。由费希尔PLSD试验计算的P值，当MCP浓度为 0.05％，0.1％和0.25％时小于0.001 ，当MCP0.01％时为P值为0.003。因此，MCP对肿瘤细胞和血管内皮细胞相互作用的抑制能会影响粘合作用，这在侵袭和转移中发挥重要作用。

讨论

膳食成分的使用对于保护和/或预防癌症的进展和转移的作用是研究的一个重要新兴领域。寻找新的食物补充剂并了解它们的作用机制是使用功能性食品作为癌症治疗方式的主要挑战。

    先前的研究显示，果胶水解，是否口服（18）或静脉注射（19），都降低了自发和实验的肺肿瘤细胞定植。不溶于水纤维形式的CP也可减少化学诱导结肠癌发病率（17），想必是通过促进双歧杆菌实现的（26）。被喂养含15％CP的饮食的大鼠表明了较高结肠癌细胞凋亡指数（23-25​​）。当人类前列腺JCA-1细胞在含有MCO的媒介中生长，报告显示出降低的细胞生长率和相应的[3H]胸腺嘧啶掺入到DNA中的几率（22）。果胶也被发现对硝基化合物具有抗突变活性（32）。每日口服MCP能减少BALB / c小鼠植入结肠-25肿瘤的生长，膳食果胶减少了来自瘤肿瘤细胞株TLT和EMT6的肌注移植小鼠肿瘤的增长（33）。目前的研究结果是首次报告显示，一种可溶性，口服摄入的碳水化合物纤维能抑制肿瘤的生长和原位生长乳腺癌和结肠癌细胞的转移。

数据表明，MCP可能通过抑制血管生成减少乳腺和结肠肿瘤生长和转移。在裸鼠口头摄入MCP7个星期后，在裸鼠乳腺脂肪垫的乳腺肿瘤细胞里，我们发现在肿瘤体积平均减少70.2％（图1）。

与之伴随着血管减少66％以及对转移到肺部完全的抑制作用（图3）。同样，对于植入人结肠癌细胞（LSLiM6）的裸鼠，与对照组相比，喂食MCP组有明显的肿瘤负担的减轻。对照组淋巴结节点和肝脏转移为100％和66％，而MCP喂养小鼠则为25％和0％。

果胶由 “光滑的”和“多毛的”的区域组成。光滑的区域由部分酯化的半乳糖醛酸残基组成，多毛的”的区域含有半乳糖醛酸残基，不规​​则插入鼠李糖残基，侧链则含中性糖，如阿拉伯糖，半乳糖，葡萄糖，甘露糖，木糖。通过pH值将CP改良至MCP包括通过贝塔排除法（高pH）将主要半乳糖醛酸链的降解，其次是天然碳水化合物（低pH值）的部分降解，产生了与未改良CP糖类成分基本相同的更简单的碳水化合物。 CP和MCP成分分析表明MCP的半乳糖，鼠李糖，木糖（数据未所示）更丰富。 MCP有效的结合重组半乳糖凝集素-3，通过阻断碳水化合物结合域抑制半乳糖凝集素-3-介导的功能，比如同型肿瘤细胞聚集，肿瘤血管内皮细胞的结合，贴壁独立的增长，以及对粘连配基的结合（18-20）。我们的研究结果表明MCP也作为一个血管生成抑制剂。在体外实验中，血管内皮细胞迁移和分化成毛细血管结构，或者MCP阻止这种迁移和毛细管形成，无论是通过结合目前矩阵的半乳糖凝集素-3和/或内皮细胞，或干扰其受体结合。在体内，这会导致肿瘤相关的血管密度明显减少。同样MCP之所以能抑制半乳糖凝集素-3表达的乳腺癌细胞株MDA-MB-435与内皮细胞的结合，部分解释为对侵袭和转移的抑制作用。最近研究结果表明，血癌转移源自癌细胞血管增长并附着到内皮细胞，而不是淤血（34）。这表明肿瘤血管内皮细胞的相互作用在癌症转移中起关键作用。在这里，我们已经表明，MCP能抑制半乳糖凝集素-3诱导和碱性成纤维细胞生长因子诱导的趋化迁移，其他报道，肝素的存在时，CP抑制碱性成纤维细胞生长因子结合其受体FGFR，也是一个复杂的碳水化合物（35）。

总之，我们的研究结果表明，MCP通过阻隔半乳糖凝集素-3及其受体的结合抑制体外和体内碳水化合物介导血管的生成。这些数据强调了膳食碳水化合物作为癌症的预防和/或治疗剂的重要性。碳水化合物的复杂性使得能识别血管生成因子和糖缀合物受体的新拮抗剂的发展十分必要。